HPLC法同步测定维生素预混合饲料中5种B族维生素

梁琳，王英

（广东省农业科学院农产品公共监测中心，广东广州510640）



HPLC法同步测定维生素预混合饲料中5种B族维生素

梁琳，王英

（广东省农业科学院农产品公共监测中心，广东广州510640）

本实验建立同步测定维生素预混合饲料中烟酸、烟酰胺、维生素B6、维生素B2和维生素B1等5种B族维生素的高效液相色谱（HPLC）法。采用Hypersil C18色谱柱（250 mm×4.0 mm，5 μm），流动相为pH 3.0的磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L KH2PO4-0.005 mol/L辛烷磺酸钠-0.5%三乙胺）-甲醇（V/V，75∶25）等度洗脱，柱温为35℃，流速为1.0 mL/min，紫外检测器在波长275 nm进行检测，外标法定量。结果表明，烟酸和烟酰胺的线性范围为75～1500 μg/mL，维生素B6、维生素B2和维生素B1的线性范围为25～500 μg/mL，线性相关系数为0.9996～0.9999，平均回收率为98.5%～100.6%，相对标准偏差（RSD）为0.21%～0.61%。此方法具有简单、快速和准确的特点，适用于维生素预混合饲料中5种B族维生素含量的同步测定。

高效液相色谱法；维生素预混料；B族维生素

B族维生素是一组重要的水溶性维生素。烟酸、烟酰胺、维生素B6、维生素B2和维生素B1同属B族维生素，参与动物体内糖、脂肪、蛋白质等营养物质的代谢，在强化免疫系统、增强抗应激能力、预防疾病、提高繁殖性能、改善畜产品品质等方面起着其他营养素不可替代的作用。B族维生素种类多，结构复杂，分析测定比较困难，应用高效液相色谱（HPLC）法测定水溶性维生素，样品前处理简单，分离速度快，特异性强，准确度高，可实现多种维生素组分的测定（王小峰，2015；邵桃玉和赵国琦，2007）。本实验采用HPLC法，同时测定维生素预混合饲料中烟酸、烟酰胺、维生素B6、维生素B2和维生素B1。方法简便、快速和准确，可满足实际应用中对维生素预混合饲料产品检测和质量监控的需要。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂仪器：Agilent 1260型高效液相色谱仪（配G1314B紫外检测器）、HU20500B型数控超声波清洗器、THZ-82A恒温振荡器、PHS-3C型酸度计、sartorius赛多利斯万分之一天平。烟酸、烟酰胺、维生素B6、维生素B2、维生素B1标准品（SIGMA公司）。甲醇和乙腈，色谱纯；三乙胺、乙酸、辛烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、KH2PO4，均为优质纯；Milli-Q超纯水。

1.2色谱条件色谱柱：Hypersil C18色谱柱（250 mm×4.0 mm，5 μm），柱温：35℃。流动相为pH 3.0的磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L KH2PO4-0.005 mol/L辛烷磺酸钠-0.5%三乙胺）-甲醇（V/V，75∶25）等度洗脱，流速：1.0 mL/min，紫外检测波长：275 nm，进样体积：20 μL。

1.3标准溶液的配制和测定混合标准储备液：分别精密称取标准品烟酸、烟酰胺、维生素B6、维生素B2、维生素B1各适量，置于100 mL棕色容量瓶中，加70 mL流动相溶解，90℃水浴振荡提取30 min，冷却后用流动相定容至刻度，配制成每毫升含烟酸1.50 mg、烟酰胺1.50 mg、维生素B60.50 mg、维生素B20.50 mg、维生素B10.50 mg的混合标准品储备液。

混合标准工作液：精密移取标准品储备液，用流动相稀释成每毫升含烟酸150 μg、烟酰胺150 μg、维生素B650.0 μg、维生素B250.0 μg、维生素B150.0 μg的混合标准品工作液。标准品图谱见图1。

图1　5种维生素混合标准品色谱图

1.4实验样品溶液的制备和测定准确称取0.3～0.5 g维生素预混合饲料，精确至0.0001 g，置于100 mL棕色容量瓶中，加70 mL水，90℃水浴振荡提取30 min，冷却后用水定容至刻度，摇匀过滤后为样品液，HPLC上机测定，外标法计算含量。样品图谱见图2。

图2　维生素预混合饲料样品色谱图

2　结果

2.1系统适应性实验在上述色谱条件下，5组分的出峰顺序依次为烟酸、烟酰胺、维生素B6、维生素B2、维生素B1，保留时间分别为3.54、3.91、4.85、8.42、9.48 min，各组分之间的分离度为1.97、4.39、11.99、2.47，均大于1.5；理论踏板数依次为8106、5535、8059、7890、6391，均大于5000。证明柱效高和分离效果好。

2.2精密度取混合标准储备液，稀释10倍后连续进样6次，得到5组分色谱峰面积的相对标准偏差（RSD），分别为烟酸0.20%、烟酰胺0.71%、维生素B60.25%、维生素B20.59%、维生素B10.14%，保留时间的RSD分别为烟酸0.16%、烟酰胺0.23%、维生素B60.46%、维生素B20.93%、维生素B11.12%，均小于2%。表明本方法精密度良好。

2.3线性关系及线性范围以混合标准储备液最高浓度，分别稀释成2、5、10、20倍等5个浓度的系列标准溶液，每个浓度进样20 μL，记录色谱图，以峰面积（Y）与浓度（X）进行线性回归计算，结果见表1。

表1　5种维生素回归方程和线性范围

2.4回收率实验为了考察方法的可靠性，在线性范围内，分别添加高、中、低3个浓度水平的标准溶液，每个水平3个重复进行测定，结果5组分平均回收率均大于98%，RSD均小于2%（表2）。证明此方法准确可靠。

表2　5种水溶性维生素的回收率和相对标准偏差

3　分析与讨论

3.1色谱柱的选择对水溶性维生素进行分析，通常采用C18色谱柱，其保留性强、分离效果好（赵艳等，2015；王海霞，2007）。本实验分别选用C18色谱柱长（250 mm×4.0 mm）、中（150 mm× 4.6 mm）、短（125 mm×4.0 mm）三种柱型测定样品，结果中短柱峰的保留时间短，各组分不能很好分离，而长柱（250 mm×4.0 mm）的分离效果较好，能准确分离五组分，虽然长柱分离时间略长，但分离效果好，考虑对于多成分的检测，最终选择长柱。

3.2检测波长的选择将5种维生素对照品分别用紫外光谱扫描，得到各组分的最大吸收波长：烟酸和烟酰胺为265 nm，维生素B6为290 nm，维生素B2为270 nm，维生素B1为250 nm，因维生素B6和维生素B2的响应值比较高，综合考虑选择275 nm。

3.3流动相及离子对试剂的选择参照崔蓉等（2005）的方法，流动相选择磷酸二氢钾缓冲盐-甲醇体系，因缓冲盐能调节流动相pH，起到缓冲作用，从而改变出峰时间，使被测物质在色谱体系中更稳定；由于B族维生素在水中可以解离为带电荷的离子，在流动相中加入离子对试剂，使其形成中性离子对，即可促进物质在色谱柱内分离，也对峰型起到改善作用。实验对辛烷磺酸钠和庚烷磺酸钠两种常用的离子对试剂进行比较，结果分离效果一致，只是维生素B2和维生素B1的出峰顺序互换，因此本实验选择辛烷磺酸钠。磷酸缓冲盐和离子对试剂两者联用可达到多种维生素更好地分离。

3.4流动相pH的选择调节流动性的pH可以控制维生素的电离，使其在色谱柱上有一定的保留，达到调节保留时间，控制分离度的目的（常湘娜等，2004）。因B族维生素在酸性条件下比较稳定，所以选择pH值为4.0、3.0和2.0三种情况下进行比较实验，结果pH为3.0时分离效果较好。

3.5流动相配比的选择比较甲醇体积分数分别为30%、25%和20%时的分离效果，当甲醇的体积分数为30%时，出峰时间太快，色谱峰保留时间太短，造成烟酸、烟酰胺和维生素B6无法分离，当甲醇体积分数为20%时，维生素B1色谱峰保留时间太长，而甲醇体积分数为25%时，各目标物在12 min内完全分离，且干扰小，最终确定甲醇的体积分数为25%。

3.6提取液的选择维生素预混料是由多种维生素单体和载体混合而成，载体通常选用以淀粉为主要成分的玉米粉和麸皮，其维生素含量甚微，因此对维生素预混合饲料中维生素的测定，主要是测定其中所添加维生素单体的含量。尹江伟等（2000）报道了B族维生素提取的多种方法，包括酸溶液浸提、流动相及水溶解等。本实验采用水、水-甲醇-乙酸混液（V/V/V，94∶50∶10）和流动相三种提取液进行比较，RSD均小于2%，证明检测结果一致，可见水能完全将5组分溶解提取，故选择最简单、无污染的水作为提取液（表3）。

表3　三种提取液的比较结果（n=3）

3.7提取方式和提取时间的选择采用90℃水浴振荡和超声波两种方式提取，提取时间选择20、30、40 min，从表4结果可见，超声波提取法比90℃水浴振荡提取法的测定结果低，估计是超声波提取的温度达不到5组分的完全溶解；同一提取法不同时间的检测结果一致，RSD均小于2%，为了保证5组分维生素在含量高时能充分溶解，最后选择90℃水浴振荡30 min提取（表4）。

表4　不同提取方法和时间比较结果

3.8样品测定结果比对为了确定本方法测定结果的准确性，将本方法与国家标准方法进行比对。由表5结果可知，两种方法测定结果的相对偏差分别为烟酰胺0.90%、维生素B60.06%、维生素B20.96%、维生素B10.30%，均小于1.0%，符合国

表5本方法与国标方法比对结果

g/kg维生素标示量本方法测定量国标方法测定量烟酰胺100109107维生素B68.008.138.14维生素B210.010.310.5维生素B15.005.095.06

家标准规定的相对偏差小于5.0%，证明本方法的测定结果准确可靠。

4　结论

本实验建立了高效液相色谱法同步测定维生素预混合饲料中烟酸、烟酰胺、维生素B6、维生素B2和维生素B1等5种B族维生素，通过试验条件的优化，采用水为提取液，pH 3.0的磷酸二氢钾缓冲盐-甲醇体系（V/V，75∶25）为流动相，辛烷磺酸钠作为离子对试剂，等度洗脱，紫外检测器检测，结果表明，此方法分离效果好，精密度高，回收率均大于98%，12 min内实现5种B族维生素的完全分离测定，为维生素预混料产品中5种B族维生素指标的同时监控提供了一种简单、快速和准确的检测方法。

［1］常相娜，黄荣清，王正平，等.B族维生素测定方法研究进展［J］.科学技术与研究，2004，4：312～316.

［2］邵桃玉，赵国琦.高效液相色谱测定维生素的研究［J］.饲料工业，2007，28（18）：55～58.

［3］崔蓉，李皎，王洪玮，等.水溶性维生素的高效液相色谱测定方法的研究［J］.中国卫生检验杂志，2005，15（1）：55～57.

［4］王小峰.高效液相色谱法测定预混料中维生素的研究［J］.价值工程，2015，7：284～285.

［5］王海霞.高效液相色谱法测水溶性维生素综述［J］.湖南饲料，2007，1：37～39.

［6］尹江伟，苏红卫.高效液相色谱法同时测定水溶性维生素［J］.泸州医学院学报，2000，23（5）：425～427.

［7］赵艳，扬发树，刘耀敏，等.反相高效液相色谱法测定预混料中3种水溶性维生素［J］.饲料研究，2015，1：55～57.

To develop a high performance liquid chromatography（HPLC）method for simultaneous determination of five B-group vitamins including nicotinic acid，nicotinamide，and vitamin B6，B2，B1in vitamin premixes.HPLC analytical column was C18column，column temperature was 35℃.The mobile phase was pH 3.0（0.01 mol/L KH2PO4-0.005 mol/L1-Octanesulfonic acid sodium salt-0.5%TEA）-methanol（V/V，75∶25）with gradient elution，The flow rate was 1.0 mL/min，The UV detection wawelength was 275 nm.The results showed that calibration curves of five vitamins were linear in the range of 75～1500 μg/mL for nicotinic acid and nicotinamide，25～500 μg/mL for vitamin B6，B2，B1，and the linear correlation coefficient was 0.9996～0.9999.the average recovery was 98.5%～100.6%，The relative standard deviations（RSD）were 0.21%～0.61%.The method was simple，rapid and accurate，and it was suitable for simultaneous detecting five B-group vitamins in vitamin premixes.

HPLC；vitamin premixes；B-group vitamins

中国·猪营养国际论坛

S816.17

A

1004-3314（2016）01-0021-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160107