细极链格孢发育及其侵染铁皮石斛的显微观察

汪正红，李　祥，杨文超，丁　丽，陈俊梅，薛春丽，潘正琼，孔　琼，杨申宣

（1.红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自 661199；2.蒙自市农业技术推广中心，云南蒙自 661199）

细极链格孢发育及其侵染铁皮石斛的显微观察

汪正红1，李祥1，杨文超1，丁丽1，陈俊梅1，薛春丽1，潘正琼2，孔琼1，杨申宣1

（1.红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自 661199；2.蒙自市农业技术推广中心，云南蒙自 661199）

细极链格孢是引起铁皮石斛黑斑病的病原菌。文章观察病原菌的生长发育及其侵染铁皮石斛叶片过程。结果表明：细极链格孢发育速度较快，通过伤口侵染寄主植物，并能在叶片上萌发、生长和定殖，从而引起病害。分生孢子于12h时萌发，24h形成菌丝，第3-4d产生孢子梗，并在其上着生链状分生孢子，第5-6d时产生大量菌丝和分生孢子，并布满了整个伤口组织。

细极链格孢；发育；铁皮石斛；侵染

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是兰科石斛属多年生草本植物，在抗衰老、抗肿瘤、降低血糖和治疗白内障等方面具有很好疗效.［1］由于野生资源稀少不能满足市场需求，人们开始大规模种植，随着种植面积扩大和年限的延长，铁皮石斛上各种病害日益加重.据田间调查发现疫病、炭疽病、黑斑病、茎基腐病等为铁皮石斛的主要病害，［2］其中由细极链格孢（Alternaria tenuissima）引起的黑斑病在云南屏边、文山、西双版纳、泸西等铁皮石斛种植基地尤为严重，发病率高达30-50%.细极链格孢不但能通过病原孢子或菌丝的机械压力侵入寄主，还会在繁殖过程分泌产生次生代谢产物（毒素）对寄主植物产生危害，而这些代谢产物还会残留与植物体内，人类食用后具有诱变和致癌的作用.［3］因此该病原菌不仅影响铁皮石斛的生长发育，还严重影响铁皮石斛品质.

铁皮石斛黑斑病的研究文献较少，主要侧重于病原菌鉴定、生物学特性及室内化学药剂筛选等方面，［4-8］而关于病原菌是如何侵染铁皮石斛叶片的文献较少.因此本文选取铁皮石斛叶片和细极链格孢菌种为试验材料，观察其生长发育和细极链格孢侵染铁皮石斛叶片的过程，为进一步研究病原菌的致病机制和病害防治提供理论依据.

1　材料与方法

1.1供试材料

选取铁皮石斛黑斑病病原菌—细极链格孢为供试菌种；移栽驯化3个月的铁皮石斛组培苗叶片为接种材料；所用培养基为清水琼脂培养基和PCA（胡萝卜200g、马铃薯200g、琼脂17g、蒸馏水1000ml）.

1.2方法

1.2.1菌种培养及孢子悬浮液制作

将菌种接于PCA平板培养基上，置于27±1℃人工培养箱中培养10d，光照强度为60%，光周期为L：D=12：12，并用无菌水制成1×106个/ml孢子悬浮液.

1.2.2细极链格孢生长发育情况观察

取1mL孢子悬浮液涂抹于清水琼脂培养基于1.2.1中培养条件下培养，分别于不同的培养时间下取样进行显微观察.即将小段透明胶带贴于接种了孢子悬浮液的清水琼脂培养基上，随后将胶带取下置于载玻片上滴一滴蒸馏水，加盖玻片在显微镜下观察.

1.2.3细极链格孢菌对铁皮石斛叶片的侵染过程

选取健康长势一致的铁皮石斛叶片作为实验材料，采用针刺法接种，每片叶片接种10ul孢子悬浮液（浓度为1×106个/ml），随后将接种后的植株置于人工气候箱内进行培养，并于不同时间下取样染色、脱色后进行观察。培养温度为27±1℃，相对湿度99%，光照强度为60%，光周期为L：D=12：12.

具体方法为：将取样后的叶片放入染色液中煮沸5min，然后置于脱色液中脱色12h，以蒸馏水做浮载剂进行显微观察.染色液配方：10ml甘油、10ml乳酸、10g苯酚、10mg甲基蓝，几种混合后溶于10ml蒸馏水中，加热溶解.脱色液配方：0.15%三氯乙酸溶解于体积比为3：1乙醇和氯仿混合溶液中.［4］

2　结果与分析

2.1细极链格孢发育情况

在不同培养时间下，细极链格孢生长发育速度较快，具体情况见图1.孢子在12h开始萌发（图1-B），形成单个或多个芽管；随后芽管向各方向生长，形成菌丝（图1-C）；第4-5d时，菌丝生长到后期分化形成颜色较深且粗壮的分生孢子梗，且着生有链状分生孢子（如图1-DE）.之后菌丝老化加重，颜色不断加深，繁殖能力下降（图1-F）.

图1　细极链格孢菌在清水琼脂培养基上的生长情况

2.2细极链格孢菌对铁皮石斛的侵染

2.2.1叶片侵染症状观察

前期实验发现细极链格孢在无伤口的铁皮石斛叶片上发病时间较长，因此本文采用针刺法进行接种.在有伤口的情况下，铁皮石斛叶片被细极链格孢侵染后的发病过程（见图2），对照不发病.并且该菌的发病病程较长，于接种第4d时叶片呈现可见的浅黄色病斑，随后病斑逐渐扩大，第7d时的叶片出现黄褐色病斑（图2-B）；第12d时发病症状更加明显，黑色圆形病斑，同时病部组织破裂并出现凹陷，（图2-C）；第22d时，病斑周围叶片变黄，随后整片叶片变黄脱落（图2-D）.

图2　细极链格孢侵染铁皮石斛的发病情况

2.2.2细极链格孢菌对铁皮石斛侵染的显微观察

将细极链格孢接种于铁皮石斛叶片，12h后在叶片可观察到刚萌发的分生孢子（图3-B），第2d时萌发后的菌丝开始向各个方向生长，随后形成茂密的菌丝（图3-C）；第4d时，组织表面可观察到很多菌丝，并侵入到寄主植物组织内部，且菌丝分化形成大量的产孢梗（图3-D）；第5d时在菌丝内部观察有大量的分生孢子产生（图3-E）；第6d时，伤口处布满大量菌丝和分生孢子，且可见症状较为明显（图3-F），这与观察到的可见症状相吻合.同时细极链格孢在铁皮石斛叶片上的侵染过程也与该菌的生长发育具有一致性.

图3　细极链格孢在铁皮石斛叶片定殖后的显微情况

3　小结与讨论

细极链格孢是一种植物病原真菌，具有广泛的寄主范围，给农业生产带来巨大损失，同时其代谢过程产生的毒素也给人类的健康带来危害.因此研究其致病机制对于该病的防治尤为重要.而在铁皮石斛种植过程，严重制约其生产的重要病原菌即时黑斑病，该病在气候合适的条件下发病率较高，造成铁皮石斛的大量减产，因此本文对其病原的生长发育和侵染过程进行了观察，以期为该病害的防治提供依据.

通过染色后进行显微镜观察，发现细极链格孢以单个分生孢子着陆于寄主植物组织表面，然后萌发并产生芽管，芽管可从孢子侧面和顶端萌发，随后从伤口侵入寄主植物体内，该结果与苹果链格孢和银海枣链格孢的侵染过程具有一定相似性［9-10］；当病原菌侵入寄主体内后，分泌毒素（另文发表）或者酶，杀死和降解寄主组织，同时产生许多围绕细胞间隙生长的菌丝，在伤口周围的组织中扩展，引起寄主组织解体，从而造成叶片黄化和脱落.

［1］郁美娟，孟庆华，黄德音，等.石斛属植物有效成分及药理作用研究［J］.中成药，2003（11）：918-921.

［2］李戈，李荣英，高薇薇.药用石斛规模化种植中的病害问题及防治策略［J］.中国中药杂志，2013，38（4）：485-487.

［3］M. Á. Pavón Moreno，I. González Alonso，R. Martín de Santos y，et al. The Importance of Genus Alternaria in Mycotoxins Production and Human Diseases［J］. Nutr Hosp. 2012，27（6）：1772-1781.

［4］张敬泽，郑小军.铁皮石斛黑斑病病原菌的鉴定和侵染过程的细胞学研究［J］.植物病理学报，2004，34（1）：92-94.

［5］桑维钧，李小霞，练启仙，等.赤水金钗石斛黑斑病菌生物学特性及防治研究［J］.云南大学学报，2007，29（1）：90-93.

［6］王仕玉，萧凤回.齿瓣石斛病原链格孢菌生物学特性研究［J］.华北农学报，2009：243-246.

［7］张敬泽，方钰蓉，张海松，等.铁皮石斛黑斑病菌室内药效试验［J］. 植物保护，2005，31（1）：44-47.

［8］曹星星.铁皮石斛病原其菌分离与鉴定及印度梨形孢促生作用研究［D］. 杭州：浙江大学，2015.

［9］张彩霞，陈莹，李壮，等.苹果链格孢菌与寄主叶片互作的超微结构研究［J］.西北植物学报，2012，32（1）：0106-0110.

［10］孙思，王军.五种整叶透明染色法显微观察链格孢侵染银海枣的比较试验［J］. 陕西农业科学，2005（5）：40，49.

［责任编辑 鲁海菊］

Microscopic Observation on Development of Alternaria Tenuissima and Its Infection on Dendrobium Officinale

WANG Zheng-hong1，LI Xiang1，YANG Wen-chao1，DING Li1，CHEN Jun-mei1，XUE Chun-Li1，PAN Zheng-qiong2，KONG Qiong1，YANG Shen-xuan1
（1.College of Life Science and Technology，Honghe University，Mengzi 661199，China；2.Agricultural Techniques Extension Center of Mengzi City，Mengzi 661199，China）

Alternaria tenuissima was a pathogen of black spot in Dendrobium officinale. The development of Alternaria tenuissima and its infection process on leaves of Dendrobium officinale were observed in this paper. The results showed that growth rate of Alternaria tenuissima was fast，infected host by wound，then it could germinate and colonize on leaves of Dendrobium officinale. Conidia of Alternaria tenuissima germinated in 12h，hyphae forming in 24h，conidiophores producing in 3-4d of inoculation with some chain-like spores，then a large amount of hyphae and conidia were formed in 5-6d，and covering on wound tissue of host.

Alternaria tenuissima； Development； Dendrobium officinale； Infection

S432

A

1008-9128（2016）05-0049-03

10.13963/j.cnki.hhuxb.2016.05.013

2015-03-30

云南省教育厅项目（2015Y451）；红河学院大学生创新创业训练计划项目（DCXL1305）；红河学院大学生科技创新基金（SZ1408）；红河学院校级委托项目（13WT001）；红河学院硕士点植物保护一级学科建设项目；红河学院大学生创新创业实践训练平台建设项目（CXSJ1304）

汪正红（1993-），女，云南施甸人，红河学院生命学院学生；李祥（1993-），男，云南富源人，红河学院生命学院学生。

孔琼（1976-），女，云南宣威人，副教授，博士，研究方向：植物抗病性研究。