含羞草中总黄酮的提取与分离纯化*

布雅楠，杨照生，闫正，罗丹，张玲玲

（河北大学化学与环境科学学院，河北保定 071002）

含羞草中总黄酮的提取与分离纯化*

布雅楠，杨照生，闫正，罗丹，张玲玲

（河北大学化学与环境科学学院，河北保定 071002）

确定含羞草中总黄酮的最佳提取部位，并对其初步分离纯化。通过正交试验，分别筛选含羞草根部、茎叶及种子中总黄酮的最优提取条件，比较三者黄酮总含量，最终确定提取部位为茎叶，最佳提取条件：以70%乙醇为溶剂，按照1∶8配料比，在55～58℃下超声50 min。提取液依次用石油醚、乙酸乙酯液液萃取，蒸干上样，用乙醇水溶液以4 mL/min梯度洗脱Diaion HP-20大孔树脂，收集洗脱液并用液相色谱监测每个梯度洗脱液的总黄酮含量，得到分离纯化过的黄酮类物质。当40%乙醇洗脱部位总黄酮含量最高，达57.7%。该工艺确定了含羞草中茎叶部位总黄酮含量最高，大孔树脂初步纯化黄酮类物质有效，为含羞草中黄酮类物质的应用提供了依据。

含羞草；黄酮类物质；正交试验；大孔树脂

含羞草为豆科含羞草属多年生草本植物。具有顽强的生长力，在我国多地均有栽培，资源丰富。含羞草全草富含黄酮类、酚类、氨基酸、有机酸、含羞草碱等物质，具有清热利尿、化痰止咳、安神止痛、解毒、散瘀、止血等功效，可入药［1］。其中黄酮类物质具有抗脑缺血、抗心肌缺血、抗心律失常、抗氧化、抗自由基、镇痛、抑菌、抗病毒、抗肿瘤等作用［2-4］。

黄酮类物质广泛存在于植物的茎叶、根部、种子、花等部位。有文献对含羞草全草中总黄酮的提取方法进行了优化［5-6］，采用柱色谱分离纯化总黄酮，并对已纯化黄酮类物质进行了表征［7-12］，定性得到黄酮苷及黄酮碳苷等物质。目前含羞草中总黄酮的主要存在部位未见文献对照，笔者首次系统地比较了含羞草的茎叶、根部、种子3个部位的总黄酮含量，确定含羞草中总黄酮的提取部位，使用大孔树脂对其初步分离纯化，得到黄酮类化合物。该研究可为含羞草中总黄酮的工业化提取及临床应用提供参考，以及含羞草资源的开发利用奠定了基础。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Thermo Ultimate 3000型，美国赛默飞世尔科技公司；

紫外可见分光光度计：UNIC 7200型，上海尤尼柯仪器有限公司；

超声波清洁器：SK5200H型，上海科导清洁有限公司；

自动双重纯水蒸馏器：SZ-93型，上海亚荣生化仪器厂；

循环水式真空泵：SHZ-D（Ⅲ）型，巩义市予华仪器有限公司；

粉碎机：转速为25 000 r/min，浙江武义鼎藏日用金属制品厂；

架盘药物天平：感量为0.1 g，上海精科仪器有限公司；

芦丁：标准样品，上海阿拉丁生化科技有限公司；

大孔吸附树脂：Diaion HP-20型，日本三菱化学公司；

亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯：分析纯，天津华东试剂厂；

甲醇：色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司；

含羞草茎叶、根部、种子均采自海南；

实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

分别将含羞草茎叶、根部、种子样品于105℃烘干至恒重，粉碎后过250 μm（60目）标准筛，备用。

1.2.2 黄酮类物质提取

分别称取3.0 g处理好的含羞草茎叶、根部、种子样品，依次提取黄酮类物质。向茎叶样品中加入70%乙醇水溶液24 mL，浸泡30 min，于55～58℃下超声50 min；向根部样品中加入50%乙醇水溶液24 mL，浸泡30 min，于40～44℃下超声30 min；向种子样品中加入60%乙醇水溶液24 mL，浸泡30 min，于40～44℃下超声50 min。然后真空抽滤提取液，洗涤定容至50 mL，摇匀，待测。

1.2.3 定量方法

选用芦丁标准样品作为对照品，通过测定芦丁的吸光度，以标准曲线法定量计算样品中总黄酮含量。

芦丁系列标准溶液的配制：准确称取烘干至恒重的芦丁标准样品，用甲醇配制成质量浓度为0.103 g/L的芦丁标准溶液。分别移取芦丁标准溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL于6只10 mL容量瓶中，各加甲醇至约5 mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，放置6 min，再加入1 mol/L的氢氧化钠溶液4 mL，以甲醇定容至标线，摇匀备用。

标准工作曲线的绘制：将芦丁系列标准溶液静置15 min，以相应试剂为空白，于510 nm下测定其吸光度。以芦丁的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。线性回归方程：y=10.477 12x+0.008 38，线性相关系数r=0.999 9，线性范围为0.010 3～0.091 2 g/L。

2 结果与讨论

2.1 含羞草茎叶单因素试验

2.1.1 溶剂组成对黄酮提取率的影响

称取5份处理的含羞草茎叶于100 mL具塞锥形瓶中，每份3.0 g，分别加入40%，50%，60%，70%，80%的乙醇水溶液24 mL，浸泡30 min，于30～34℃超声50 min，抽滤，以对应溶剂洗涤定容，用1.2.3法平行测定3次。结果表明，随乙醇体积分数增加，总黄酮提取率先增后减，使用70%乙醇水溶液时达到最高。

2.1.2 配料比对黄酮提取率的影响

称取4份处理的含羞草茎叶于100 mL具塞锥形瓶中，每份3.0 g，分别加入60%乙醇水溶液18，21，24，27 mL，对应物料比分别为1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，浸泡30 min，于30～34℃ 超声50 min，抽滤，以对应溶剂洗涤定容，用1.2.3法平行测定3次。结果表明，随溶剂量增加，总黄酮提取率先增后减，配料比为1∶7时达到最高。

2.1.3 超声温度对黄酮提取率的影响

称取5份处理的含羞草茎叶于100 mL具塞锥形瓶中，每份3.0 g，分别加入60%乙醇水溶液24 mL，浸泡30 min，分别于30～34℃，40～44℃，50～54℃，55～58℃，58～60℃超声50 min，抽滤，以60%乙醇水溶液洗涤定容，用1.2.3法平行测定3次。结果表明，随温度升高，黄酮提取率逐渐增加，最后趋于稳定，于55～58℃时达到最高。

2.1.4 超声时间对黄酮提取率的影响

称取5份预处理的含羞草茎叶于100 mL具塞锥形瓶中，每份3.0 g，分别加入60%乙醇水溶液24 mL，浸泡30 min，分别于30～ 34℃超声10，20，30，40，50 min，抽滤，以60%乙醇水溶液洗涤定容，用1.2.3法平行测定3次。随超声时间增加，黄酮提取率先增后减，于超声50 min时达到最高。

2.2 含羞草根部单因素试验

按照2.1方法进行含羞草根部单因素试验，结果表明，随乙醇体积分数增加，总黄酮提取率先增后减，使用50%乙醇水溶液时达到最高；随溶剂量增加，总黄酮提取率先增后减，物料比为1∶7时达到最高；随温度升高，黄酮提取率逐渐增加，最后趋于稳定，于58～60℃时达到最高；随超声时间增加，黄酮提取率先增后减，于超声20 min时达到最高。

2.3 含羞草种子单因素试验［13］

按照2.1方法进行含羞草种子单因素试验，结果表明，随乙醇体积分数增加，总黄酮提取率先增后减，使用50%乙醇水溶液时达到最高；随溶剂量增加，总黄酮提取率先增后减，物料比为1∶8时达到最高；随温度升高，黄酮提取率逐渐增加，最后趋于稳定，于55～58℃时达到最高；随超声时间增加，黄酮提取率先增后减，于超声20 min时达到最高。

2.4 正交试验

基于含羞草茎叶、根部、种子的单因素试验，选择4因素3水平进行正交试验，结果分别见表1、表2、表3［13］。

表1 含羞草茎叶提取正交试验

表2 含羞草根部提取正交试验

表3 含羞草种子提取正交试验

由表1可知，影响含羞草茎叶中黄酮提取率因素的主次顺序：乙醇体积分数＞物料比＞超声时间＞超声温度。综合考虑，乙醇体积分数为70%、物料比为1∶8、超声温度为55～58℃、超声时间为50 min时含羞草茎叶提取效果最佳；由表2可知，影响含羞草根部黄酮提取率的因素主次顺序为：乙醇体积分数＞超声温度＞物料比＞超声时间，综合考虑，乙醇体积分数为50%、物料比为1∶7、超声温度为40～44℃、超声时间为30 min时含羞草根部提取效果最佳；由表3可知，影响含羞草种子中黄酮提取率的因素主次顺序：乙醇体积分数＞超声时间＞物料比＞超声温度，综合考虑，乙醇体积分数为60%、物料比为1∶8、超声温度为40～44℃、超声时间为50 min时含羞草种子提取效果最佳。

2.5 含羞草茎叶、根部、种子黄酮含量比较

在最佳条件下对含羞草茎叶、根部、种子进行提取，用1.2.3法测定总黄酮含量，茎叶部分总黄酮含量为44.9 mg/g，根部总黄酮含量为93.0 mg/g，种子总黄酮含量为0.367 mg/g。种子中总黄酮量过少，不适合进一步工业化提取；根部虽然总黄酮含量较高，但在整株质量中占比较低，且存在不易采样、清洗、粉碎、工业量化提取等缺点；而含羞草茎叶部分在总植株质量中占比近90%，且易于采样和初步处理，工业量化提取方便，故最终提取时以含羞草茎叶作为样品，进一步分离纯化。

2.6 黄酮类物质的纯化

2.6.1 黄酮粗提取

取含羞草茎叶10 kg粉碎，用70%乙醇水溶液按1∶8配料比浸泡30 min，于55～58℃下超声50 min提取，抽滤。粗提液旋蒸至无醇味，依次用3倍体积石油醚、乙酸乙酯萃取至无色，乙酸乙酯萃取液于35℃旋蒸至浸膏状，备用。

2.6.2 大孔树脂纯化黄酮

采用Diaion大孔树脂对黄酮粗提取物进行分离纯化［14-15］。用无水乙醇浸泡Diaion HP-20大孔树脂24 h，湿法装填层析柱（100 cm×2.5 cm），将乙酸乙酯浸膏上样，分别用0%，20%，40%，60%，80%，100%无水乙醇梯度淋洗，调节流量为4 mL/min，每100 mL洗脱液使用高效液相色谱仪监测（100%甲醇，1.5 mL/min，260 nm），各梯度洗脱液中黄酮浓度先增后减，当浓度再次上升时，即为下一洗脱液梯度，合并同一梯度洗脱液组分，蒸干，称重，结果见表4。由表4可知，乙醇体积分数为40%时，洗脱液中黄酮含量最高。

表4 淋洗剂对黄酮纯化的影响 %

3 结论

通过正交试验考察黄酮最佳提取条件，比较各部分总黄酮含量，考虑各部分占植株质量分数，确定茎叶为最终提取部位。大量提取后，使用液液萃取得到乙酸乙酯部分浸膏，以Diaion HP-20大孔树脂初步分离纯化，确定以40%乙醇水溶液洗脱洗脱液中比重最大，总黄酮含量最高。

根据实验结果得到黄酮的提取纯化工艺：新鲜含羞草茎叶→干燥后粉碎→最优条件超声提取→提取液→减压浓缩→石油醚萃取→水层用乙酸乙酯萃取→乙酸乙酯萃取液旋蒸至浸膏→浸膏上Diaion HP-20大孔树脂柱→乙醇水梯度洗脱→每100 mL洗脱液以液相色谱仪监测→将40%乙醇洗脱液合并，减压浓缩至浸膏→样品。

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兴奋剂检测有望几分钟出结果

澳洲的研究人员正在改善警方进行路边临检的检测技术，这种技术未来可以用在奥运等运动赛事，大幅缩短运动禁药检测的时间。

目前运动禁药检测仍需要采集运动员的血液及尿液，而且可能需时数天才能获得检测结果。南澳大学教授佛克尔（Nico Voelcker）表示，血液检验具有很大的侵入性，尿液检验则可能会被掺入其它成分，而两种检验都需花上数小时才能获得结果，检体在这段期间可能会遗失，或与其它选手的检体混淆。

佛克尔说，WADA的补助款项让他们能在明年修正检验技术，只要有运动员的唾液和汗水，就能检验他们有没有使用能提升运动表现的禁药，而且几分钟内就能获得结果。

他表示，市场不断出现能提升运动表现的物质，但目前的检测方式却无法快速反应这股趋势。他指出，新技术是针对分子进行检测，“我们会先用雷射光激发高表面积物质，进而将分子释放出来，然后再用质谱仪检测这些分子。这种特别的技术不仅能够检测某一种特别的药物，还能检测许多可能已进到体内的药物”。

（中国分析计量网）

上海拟修法固化食品安全信息追溯管理制度

不久前，在上海市政府新闻办举行的发布会上得知，上海正在修订《上海市实施〈中华人民共和国食品安全法〉办法》，目前已形成修订草案并报市政府法制办审核。

上海市食品药品监督管理局局长阎祖强表示，《办法（修订草案）》将体现上海市近年来在食品安全监管实践中所形成的制度成果，把上海市实施全程监管的食品安全信息追溯管理制度，以及餐厨废弃油脂管理、食品安全责任保险、农村集体聚餐等监管经验以地方立法予以固化。

（网易财经）

Extraction and Purification of Flavonoids in Mimosa

Bu Yanan， Yang Zhaosheng， Yan Zheng， Luo Dan， Zhang Lingling
（College of Chemistry and Environmental Science ， Hebei University， Baoding 071002， China）

The extracted parts of mimosa was confirmed and a feasible process was developed to simultaneously separate and purify flavonoids in it. The optimal extraction conditions of total flavonoids in plant stem leaves， roots and seeds of mimosa were picked out by orthogonal experiment. Considering total flavonoids content， the final extracted part was confirmed as plant stem leaves， the optimum extraction conditions were 70% ethanol according to 1∶8 ratio， ultrasound extracted at 55-58℃for 50 min. Petroleum ether and ethyl acetate were used to extract the extracts in sequence， and then dried， Diaion HP-20 macroporous resin were gradient eluted with ethanol aqueous at a rate of 4 mL/min， each gradient part of total flavonoids were collected by HPLC， the preliminary purified and separated flavonoids was got. 40% ethanol elution fraction contents the most highest total flavonoids about 57.7%. The process confirmed that the stem leaves content the highest flavonoids in mimosa and macroporous resin were effective in initial purification of flavonoids， which provided the basis for the application of flavonoids in mimosa.

Mimosa； flavonoids； orthogonal experiment； macroporous resin

0657.5

A

1008-6145（2016）05-0012-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.05.003

*国家自然科学基金项目（31370051）

联系人：闫正；E-mail： yanzh@hbu.edu.cn

2016-07-22