六味地黄汤对5/6肾切除大鼠NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ表达的影响

李岩岩，何泽云*，吴　凡，周艳利

（1.郑州市第三人民医院，河南郑州450000；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；3.广州市中医医院，广东广州510130）

六味地黄汤对5/6肾切除大鼠NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ表达的影响

李岩岩1，何泽云2*，吴凡1，周艳利3

（1.郑州市第三人民医院，河南郑州450000；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；3.广州市中医医院，广东广州510130）

目的观察六味地黄汤对5/6肾切除大鼠残肾转录因子-核因子κB（NF-κB）、单核细胞趋化因子（MCP-1）及Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）表达的影响，探讨六味地黄汤抑制肾间质纤维化进展的作用机制。方法按照随机数字表法将60只SD雄性大鼠分为5组：空白组、假手术组、模型组、依那普利组、六味地黄汤组，每组12只，后三组行5/6肾切除术诱导大鼠肾衰模型，假手术组同期手术，但不损及肾脏。造模术后3 d进行灌胃干预。灌胃8周后处死各组大鼠，观察各组大鼠残肾组织形态学变化并用免疫组化法检测大鼠残肾NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ的表达。结果（1）观察5/6肾切除大鼠残肾组织细胞形态学，与模型组相比六味地黄汤、依那普利组可减轻大鼠肾间质损害及纤维化程度；（2）免疫组化半定量分析显示六味地黄汤组肾皮质的NF-κB、MCP-1及Col-Ⅲ表达均明显低于模型组（P＜0.05），与依那普利组差异无统计学意义（P＞0.05）。结论六味地黄汤可能通过下调NF-κB、MCP-1及Col-Ⅲ的表达，减少细胞外基质的积聚，减轻炎症反应和纤维化程度，抑制5/6肾切除大鼠肾间质纤维化进展，可作为慢性肾衰竭的辅助用药。

六味地黄汤；5/6肾切除；转录因子-核因子κB；单核细胞趋化因子；Ⅲ型胶原

〔Abstract〕Objective To observe the effects of Liuwei Dihuang decoction on the expression of nuclear factor kappa B（NF-κB），monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）and collagen type III（Col-Ⅲ）in remnant kidney of 5/6 nephrectmized rats，and to investigate the mechanism of action for Liuwei Dihuang decoction on renal tubulointerstitial fibrosis.M ethods The sixty male Sprapue-Dewley rats were randomly divided into five groups：blank group，sham-operation group，model group，enalapril group and Liuwei Dihuang decoction group，12 rats in each group.The model group，enalapril group and Liuwei Dihuang decoction group adopted 5/6 nephrectomized induced into renal failure model.After 3 days of modeling，the rats were treated by gavage.After 8 weeks，rats were sacrificed，remnant kidney tissue morphological changes were observed and the expression of NF-kB，MCP-1，Col-Ⅲlevels were tested by immunohistochemistry.Results（1）The cell morphology in remnant kidney of 5/6 nephrectmized rats was observed.Compared with model group，renal tubulointerstitial damage and fibrosis was reduced in Liuwei Dihuang decoction and enalapril group；（2）Compared with model group，NF-κB，MCP-1 and Col-III expression level were reduced markedly in Liuwei Dihuang decoction group（P＜0.05），there is no obvious diffrencebetween Liuwei Dihaung group and enalapril group（P＞0.05）.Conclusion Liuwei Dihuang decoction may inhibit the expression of NF-κB，reduce the expression of MCP-1，decrease the accumulation of extracellular matrix，reduce the inflammation and fibrosis and delay the progress of renal interstitial fibrosis，which can be the adjuvant drug of chronic renal failure.

〔Keywords〕Liuwei Dihuang decoction；5/6 nephrectomy；nuclear factor kappa B；monocyte chemoattractant protein-1；collagen type III

肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各种肾病进展到终末期肾病的基础，RIF的发生涉及炎性细胞浸润、肾小管损伤、肾间质成纤维细胞的增殖、细胞外基质过度沉积等过程［1］。单核细胞趋化因子（Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）是特异性单核巨噬细胞趋化因子，它借助转录因子-核因子κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB），通过其同源受体-CCR2调节RIF的发生，在进行性器官纤维化中起重要作用。NF-κB参与了多种炎症因子和促纤维化因子的合成，最终导致细胞外基质（extracellular matrix，ECM）效应细胞被激活，产生大量ECM。Ⅲ型胶原（Collagen TypeⅢ，Col-Ⅲ）是ECM的重要成分，其合成和降解的失衡是引起间质纤维化的直接原因之一。5/6肾切除是可以得到逐步进展至肾小球硬化、间质纤维化，最后出现肾功能衰竭的稳定动物模型。六味地黄汤以其安全有效的特点广泛运用于慢性肾脏病的临床治疗。本文通过探讨六味地黄汤对5/6肾切除大鼠残肾NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ的影响，探讨六味地黄汤抑制肾间质纤维化进展的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物健康SD雄性大鼠60只，体质量（200±20）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。许可证号：SCXK（湘）2013-0004。大鼠饲养环境保持通风、恒温，每日更换垫料，定期消毒笼具；每天给予12 h灯光照射。

1.1.2主要试剂与仪器兔抗大鼠NF-κBp65单克隆抗体，兔抗大鼠MCP-1单克隆抗体，兔抗大鼠Col-Ⅲ单克隆抗体，PV-9000二步法免疫组化检测试剂，DAB显色剂试剂盒均购自北京中杉金桥生物工程有限公司。FINESSE325型石蜡切片机（英国珊顿公司）；Motic BA410T生物显微镜（德国）；BM-Ⅷ生物组织包埋机、CS-Ⅵ型摊片烤片机、TS-12A型生物组织自动脱水机（孝感市宏业医用仪器有限公司）。

1.1.3实验药物六味地黄汤（熟地黄24 g，山茱萸12 g，山药12 g，泽泻9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g）由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。制备方法：先将药材用相当于药材2倍的自来水浸泡2 h，武火煮沸后再文火煎熬30 min，将两煎液混合，于水浴锅上浓缩为含生药0.1 g/mL的药液；马来酸依那普利片剂（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号H10042451）。

1.2实验方法

1.2.1分组与造模按照随机数字表法将大鼠随机等分为A组（空白组）、B组（假手术组）、C组（模型组）、D组（依那普利组）、E组（六味地黄汤组），每组12只。动物适用性喂养一周后，C、D、E组均按照文献［2］在无菌条件下行5/6肾切除手术。B组同期行两次手术，每次仅打开腹腔，暴露肾脏后，关腹。

1.2.2药物干预A、B、C组予等体积蒸馏水灌胃，1次/d；D组依那普利组以10 mg/（kg·d）溶于等容积蒸馏水灌胃，1次/d。E组予六味地黄汤剂灌胃，剂量为6.75 g/kg生药，相当于60 kg体质量成人每天75 g生药的等效剂量，1次/d；共给药8周。

1.3检测项目和方法

实验结束后处死各组大鼠并取出残肾组织称重，观察残肾大体标本形态，将残肾组织行冠状切面，浸入4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，制成4μm切片，用于光镜及免疫组化染色。

1.3.1肾脏病理检查取石蜡块，4μm切片后分别进行HE、Masson染色，MOTIC光学显微镜下观察。

1.3.2免疫组化染色采用PV-9000二步法检测残肾组织中NF-κB、MCP-1及Col-III的表达，具体操作步骤如下：（1）切片常规脱蜡至水；（2）3%H2O2室温孵化10 min，蒸馏水漂洗后；（3）热修复抗原，冷却后用PBS液漂洗两次；（4）从微波盒中拿出组织，放入保湿盒中，滴加适量的一抗工作液（约50 uL）分别为：兔抗大鼠NF-κBp65单克隆抗体，兔抗大鼠MCP-1单克隆抗体，兔抗大鼠Col-Ⅲ单克隆抗体；（5）滴加试剂1，室温孵育20 min，PBS冲洗，5 min× 3次，滴加试剂2，室温孵育20～30 min，PBS冲洗，5 min×3次；（6）DAB显色，苏木素轻度复染5 min到8 min，脱水，透明，中性树胶封片。采用IPP6.0医学图像分析系统，每张切片随机选取5个不含肾小球和小血管的肾皮质200倍视野，测定累积光密度（IOD）值，对NF-κB、MCP-1及Col-Ⅲ进行图像分析。

1.4统计学分析

2　结果

2.1动物存活情况

在造模过程及造模后两周内，模型组4只大鼠、依那普利组2只大鼠、六味地黄汤组2只大鼠死亡。死亡原因有麻醉意外、术中大出血及术后感染等。予以剔除。模型组剩余大鼠8只，依那普利组剩余大鼠10只、六味地黄汤组剩余大鼠10只。

2.2肾组织光镜检查

2.2.1HE染色5/6肾切除大鼠残肾组织HE染色显示，空白组及假手术组：肾小球结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐。模型组：肾小球明显缩小、纤维化，肾小管上皮细胞萎缩、脱落，部分管腔不规则、扩张；肾间质可见淋巴细胞浸润及大量纤维结缔组织增生；依那普利组：可见被膜纤维增厚，肾小球轻度缩小，肾小管萎缩；六味地黄汤组：肾小球肥大、小管上皮细胞水肿；肾间质少量纤维结缔组织增生及轻度水肿。见图1。

2.2.2Masson染色5/6肾切除大鼠残肾组织Masson染色显示：正常组及假手术组可见肾小球、肾小管结构正常，肾间质未见胶原纤维增生；模型组肾小球内及肾间质均可见大量胶原纤维；依那普利组可见局灶性间质纤维增生，部分小管纤维化；六味地黄汤组可见部分小管纤维化，局灶性间质纤维化，肾间质胶原纤维增加。见图2。

2.3免疫组化检测结果

2.3.1NF-κBp65的表达空白组及假手术组可见肾小球及肾间质少量阳性表达；模型组、六味地黄汤组、依那普利组均为阳性表达，以模型组表达最强，依那普利组次之，六味地黄汤组表达最弱，阳性表达主要在皮质区肾小管上皮细胞，胞浆和胞核均见，以胞核表达较强。肾小球阳性表达较弱。见图3。

2.3.2MCP-1的表达空白组、假手术组可见肾小球及肾间质少量阳性表达；模型组、六味地黄汤组及依那普利组呈阳性表达，活化信号主要见于皮质区肾小管上皮细胞，以胞浆表达较强。见图4。

2.3.3Col-Ⅲ的表达空白组、假手术组Ⅲ型胶原仅于肾间质及肾小管上皮细胞轻度表达。模型组肾小管间质可见大量阳性表达，与假手术比较表达显著增强。六味地黄汤组及依那普利组较模型组表达较弱。见图5。

经IPP（Image-pro Plus）图像半定量分析，计算切片NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ平均光密度值，进行统计学分析，模型组、六味地黄汤组、依那普利组分别与空白组和假手术组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示造模成功；与模型组比较，六味地黄汤组及依那普利组NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ平均光密度值较模型组明显减低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），提示六味地黄汤及依那普利均能降低NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ的表达；依那普利组与六味地黄汤组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1　各组大鼠残肾组织NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ平均光密度的定量分析（±s）

表1　各组大鼠残肾组织NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ平均光密度的定量分析（±s）

注：与空白组相比，△P＜0.05；与假手术组相比，▲P＜0.05；与模型组相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。

组别空白组假手术组模型组依那普利组六味地黄汤组F值P值n 12 12 8 10 10 NF-κB 0.2103±0.0140 0.2417±0.0307 0.3058±0.0099△▲0.2652±0.0089△▲★0.2643±0.0467△▲★5.321＜0.05 MCP-1 0.3003±0.0084 0.3044±0.0067 0.4148±0.0247△▲0.3644±0.0257△▲★★0.3456±0.0201△▲★★4.463＜0.05 Col-Ⅲ0.3429±0.0017 0.3437±0.0025 0.4001±0.0013△▲0.3774±0.0007△▲★★0.3762±0.0007△▲★★9.652＜0.05

图1　各组肾脏病理学光镜图（HE染色，×400）

图2　各组肾脏病理学光镜图（Masson染色，×400）

图3　各组免疫组化NF-κBp65表达光镜图（×200）

图4　各组免疫组化MCP-1表达光镜图（×200）

图5　各组免疫组化Col-Ⅲ表达光镜图（×200）

肾脏疾病进展至慢性肾衰竭的发病机制，至今尚无定论，其共同的通路包括肾脏萎缩、纤维化［3］。肾脏纤维化包括肾小球硬化和间质纤维化。RIF是指各种致病因子如炎症、损伤等作用下，间质细胞及细胞间质增多，基质蛋白合成增加，基质降解受抑制造成ECM大量堆积。目前认为RIF的主要发生机制为：（1）小管上皮细胞向间充质细胞的转分化作用；（2）主要效应细胞的激活；（3）局部缺血、缺氧［4］。炎症损伤是间质纤维化发生发展的重要因素。

3　讨论

MCP-1是特异性单核巨噬细胞趋化因子，主要由单核细胞产生，亦可由肾小管上皮细胞产生，它本身具有独特的信号通路，即借助NF-κB。可以不依赖酪氨酸激酶或者蛋白激酶的途径，通过其同源受体-CCR2调节RIF的发生，在进行性器官纤维化中起重要作用。单核/巨噬细胞浸润肾间质，肾小管上皮细胞即被活化，MCP-1分泌增多，趋化炎症细胞，参与早期炎症反应。现有的研究表明，MCP－1在多种肾脏疾病中参与了小球和间质的巨噬细胞积聚，而阻断MCP－1可以减少巨噬细胞积聚并伴肾脏损伤的减轻［5］。

NF-κB作为转录因子家族的重要成员之一，参与了多种炎症因子和促纤维化因子的合成，在免疫炎症反应、抗凋亡及肿瘤发生中起着重要的作用［6］。并且可以认为是炎性反应的触发器，活化后会“瀑布式”地诱导机体产生一系列的炎症因子（包括IL-2、IL-8及TNF等）及组织因子、粘附分子等基因的转录，包括MCP-1，发挥着中心环节作用于炎症反应中。其异常激活可能是肾小球肾炎发生的始动机制之一［7］。一些被NF-κB激活的因子又会反过来进一步诱导NF-κB的激活，生物体内产生级联放大的炎症反应。导致ECM效应细胞被激活，产生大量ECM。Ⅲ型胶原是ECM的重要成分，其合成和降解的失衡是引起间质纤维化的直接原因之一。正常情况下Ⅲ型胶原在肾小管上皮细胞及肾间质轻度表达。肾间质积聚的基质蛋白主要为I型胶原、Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白［8］。在高滤过、高灌注的状态下或血管内皮细胞发生损失时，促使肾脏产生多种细胞因子，促进肾间质成纤维细胞合成Ⅲ型胶原增加，导致间质纤维化。ECM持续性沉积通过形成纤维瘢痕，破坏正常肾组织，导致肾实质塌陷、肾功能丧失［9］。

中医理论认为肾间质纤维化的病机主要是虚、瘀、痰湿和浊毒。根据中医理论着手对补益药，活血药，化湿药，解毒药亦做过大量实验，并验证诸如黄芪、冬虫夏草、红花、丹参、大黄等单味药，黄芪当归合剂、肾衰保肾汤、归脾汤、肾康注射液等复方制剂均有一定治疗肾间质纤维化的作用［10］。本篇主要从虚着手，选用被后世誉为“补阴方药之祖”的六味地黄汤。其由熟地黄、山茱萸、怀山药、牡丹皮、泽泻、茯苓六味药组成，主治肾阴虚证。既往研究证实：六味地黄丸（汤）是临床上治疗肾阴虚证型慢性肾小球肾炎的有效方剂［11］。

本实验的阳性对照药物依那普利是血管紧张素转换酶抑制剂类药物，可降压、减少尿蛋白、减少肾小球细胞外基质的蓄积，减轻肾间质纤维化和肾小球硬化，延缓肾损害进展。本实验发现六味地黄汤组、依那普利组均可减轻5/6肾切除大鼠残肾组织的病理改变，减少肾间质中胶原纤维面积，抑制NF-κB、MCP-1及Col-Ⅲ的表达。

综上所述，肾间质NF-κB、MCP-1的高水平可引起ECM效应细胞被激活，Ⅲ型胶原合成和降解的失衡，Ⅲ型胶原增加，导致间质纤维化。六味地黄汤可能通过下调NF-κB、MCP-1及Col-Ⅲ的表达，早期干预炎症损伤，减少细胞外基质的积聚，抑制肾间质纤维化进展。因而，六味地黄汤可作为慢性肾衰竭的早期辅助用药。

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（本文编辑 杨瑛）

Effects of Liuwei Dihuang Decoction on NF-κB，MCP-1 and Col-III Expression in 5/6 Nephrectom ied Rats

LI Yanyan1，HE Zeyun2*，WU Fan1，ZHOU Yanli3
（1.The Third Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou，Henan 450000，China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China；3.Guangzhou Hospital of TCM，Guangzhou，Guangdong 510130，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.05.005

2015-11-07

湖南省科技厅项目资助（2013SK3099）。

李岩岩，女，硕士，医师，研究方向：慢性肾脏病的防治。

*何泽云，男，博士，教授，E-mail：hzy2005@zju.edu.cn。