荷叶黄酮抗氧化能力的研究

吴海霞

摘 要：该文对荷叶黄酮抗氧化能力进行了实验研究，将荷叶的抗氧化能力与已知的常用抗氧化剂维生素C和芦丁作为对照进行测定。结果发现，荷叶的乙醇提取物具有较强的抗氧化作用，可以有效的清除DPPH·自由基、·OH自由基、抑制油脂自动过氧化和抑制Fe2+诱发脂蛋白过氧化；随着荷叶提取物用量的增加，其抗氧化能力也随之增加。为实现荷叶更好的开发与利用，此文提供一定的研究参考。

关键词：荷叶；黄酮；抗氧化能力；研究

中图分类号 TQ461 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）16-0015-03

Abstract：Determination of antioxidant capacity of lotus leaf.Based on the observations above，the antioxidative capacity of the lotus leaf extract with several promulgated antioxidant were further compared，such as vitamin C and rutin.The results showed that the lotus leaf extract had better antioxidative capacity，which could effectively clear DPPH·free radical and ·OH free radical. The lotus leaf extract could inhibit the lipid auto-peroxidization and Fe2+-induced lipoprotein peroxidation were also validated.The antioxidative capacity of the lotus leaf extrac was enhanced with the increment of the amount of extract. In order to achieve better development and utilization of the lotus leaf，this paper provides a certain value of research.

Key words：Lotus leaf；Total flavonoids；Antioxidant activity；Research

荷叶是睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera）的叶片，传统医学认为：荷叶苦、平，具有清暑利湿，抑菌、清心去热，凉血、止血的作用[1]。研究表明，荷叶含有丰富的碳水化合物、脂类、蛋白质、单宁等普通化学成分外，还富含具有明显的生物活性和生理功能的黄酮类化合物等物质。近几年，研究报道有关荷叶及荷叶提取物药理作用的较多[2-5]，但对荷叶的乙醇提取物生物活性功能的综合研究比较少见。本试验进一步探索荷叶黄酮提取物的抗氧化活性，以期为荷叶的相关保健食品、药品、和食品防腐剂的开发利用提供理论依据。

为了更好地表明荷叶具有较强的抗氧化能力，本实验采用维生素C（抗坏血酸）、天然抗氧化剂芦丁（一种黄酮类化合物）和丁基羟基茴香醚（BHA）等作为参照试验进行比较。维生素C和芦丁都是已知的被广泛使用的抗氧化剂，维生素C、BHA和芦丁在清除自由基、超氧阴离子和过氧化氢、提高抗氧化酶的活性、阻断自由基所引起的氧化反应、防止体内自由基代谢紊乱等方面具有重要的生理活性作用[6]。因此，选用维生素C、BHA和芦丁作为参照试验，可以很好的表明荷叶的抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 荷叶（购买于中药药店），豆油、新鲜鸡蛋（购买于农贸市场）

1.1.2 仪器 旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）、循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、FA1104电子天平（上海天平仪器厂）、超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）、Spectrumlab 755s紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）、调解式万用电炉（南通长江光学仪器有限公司）、数显恒温水浴箱（国华电器有限公司）、离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.1.3 试剂 无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）、DPPH·（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl）（Sigma公司）、Rutin trihydrate（国药集团化学试剂有限公司）、三氯乙酸（TCA）（国药集团化学试剂有限公司）、碘化钾（国药集团化学试剂有限公司）、硫代巴比妥酸（TBA）（国药集团化学试剂有限公司）、水杨酸（国药集团化学试剂有限公司）、双氧水（上海金鹿化工有限公司）、硫代硫酸钠（国药集团化学试剂有限公司）、硫酸亚铁（国药集团化学试剂有限公司）、丁基羟基茴香醚（BHA）（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备 原料干品粉碎后，分别称取2g，放入l00mL锥形瓶中，按照一定的料液（g/mL），加入一定体积分数的乙醇溶液（%），在一定的温度（℃）下，超声提取一定时间。提取结束后，抽滤，再旋转蒸发，将粗提液中的乙醇挥发干净，加蒸馈水定容至250mL，摇匀，备用。

1.2.2 清除羟自由基能力的测定 采用Fenton法产生·OH，以水杨酸作为羟基自由基的捕捉剂，通过测定水杨酸捕捉·OH的产物来确定各样品对·OH的清除率[7-8]。向试管中分别依次加入不同浓度的芦丁和荷叶提取物样品溶液5mL，10mmol/mL水杨酸溶液1mL，pH=7.4的磷酸缓冲液3mL，2.8mmol/mL FeSO4溶液2.00mL，最后加入3%的H2O2溶液5mL，充分振荡混匀，在水浴35℃条件下保温40min，在波长510nm处测定分别测定吸光值（测定时每个样品重复测定3次，取平均值），计算羟自由基消除率：

羟自由基清除率（%）=[A0-（Am-An）]/A0×100

式中：A0为空白管的吸光值；Am为样品管的吸光值；An为样品自身的吸光值。

1.2.3 清除DPPH·自由基能力的测定 准确称取DPPH 0.0112g，用95%乙醇定容于50mL容量瓶中。用微量移液器分别取不同浓度的芦丁、维生素C和荷叶提取物样品溶液和DPPH溶液各2mL于试管中，摇匀后放置40min后在517nm处侧得吸光度A，按照下列公式计算各不同浓度的样品对DPPH自由基的清除率：

DPPH清除率（%）=[A0-（A-A2）]/A0×100

式中：A0为对照吸光度值（仅含DPPH乙醇溶液）；A2为空白对照的吸光度值（样品与无水乙醇用以消除样品本身颜色的影响）。

1.2.4 防止油脂氧化的能力测定 油脂在自然放置的条件下会发生自动氧化，造成油脂的酸败，通过测定油脂的过氧化值（POV值）可以确定油脂氧化的程度[9]。准确称取30g油脂，分别加入不同浓度的样品溶液5mL于烧杯中，放置于68℃烘箱中进行保存，每隔一定时间进行取样测定。根据测定结果来表示油脂的酸败程度，进而评价各个样品的抗氧化活性能力。油脂POV值的测定方法如下：

称取豆油混样3～4g，若有沉淀物需要进行过滤，加入到250mL具塞三角瓶中，然后加入20mL比例为2∶3的三氯甲烷-冰乙酸混合液，充分振摇。当样品全部溶解后，加入1.00mL饱和KI溶液，轻轻振摇35s，置于暗处3min。然后加85mL蒸馏水稀释摇匀，立即用0.01mol/L的硫代硫酸钠标准溶液进行滴定，至溶液颜色变为淡黄色时，滴加1mL淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失。同时要做不加试样的空白对照试验。样品的过氧化值计算如下：

POV=C×（V1-V2）/m×1000

式中：C为硫代硫酸钠的浓度，mol/L；V1为样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；V2为空白组消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；m为样品质量，g。

1.2.5 抑制Fe2+诱发脂蛋白过氧化能力的测定 分别将荷叶黄酮和维生素C配制成不同浓度的样品溶液，对其抑制Fe2+诱发脂蛋白过氧化的能力进行测定，测定方法如下[10]：

蛋黄稀释液的配制：小心将鸡蛋去壳，取出蛋黄备用，加入相同体积的0.1mol/L，pH为7.54的PBS溶液，配成蛋黄悬浮液。使用时要用磁力搅拌器搅10min后，并稀释25倍得到蛋黄稀释液。

分别向试管中加入0.4mL蛋黄稀释液，不同浓度的荷叶黄酮稀释液和维生素C溶液60μL，25mmol/L的硫酸亚铁溶液0.2mL，然后用0.1mol/L的PBS补足到2mL。对照组不加荷叶提取物溶液，其他相同。调零管与对照组一样，不同的是先加入0.5mL 20%三氯乙酸，在用PBS补足道2mL。在37℃条件下，水浴15min后，除了调零管不加三氯乙酸外，其他试管均要加入0.5mL 20%的三氯乙酸来终止反应。置4 000r/min离心机，离心8min，取上清液2.0mL，添加0.8%的硫代巴比妥酸（TBA）溶液1.0mL，封口100℃水浴15min，取出快速冷却，在532nm处测定其吸光值，每组做3个平行试验，取平均值。试验样品的抗脂蛋白过氧化活性（AOA）的抑制率按以下公式计算：

2 结果与讨论

2.1 荷叶黄酮对羟自由基清除能力 由图1可知，荷叶黄酮对·OH具有一定的清除能力，而且在荷叶黄酮的用量为90～110μg时，其对羟自由基的清除能力比10～30μg的芦丁清除率要高。

2.2 荷叶黄酮对DPPH·清除能力 由图2可知，荷叶黄酮清除DPPH·的能力比较强。通过计算，这3种样品对DPPH·清除率达到50%的清除剂量分别为：荷叶提取物为12.45μg，芦丁为17.23，维生素C为12.13。由此可以得，荷叶提取物清除DPPH·的能力与维生素C相当，但是要比芦丁的清除能力强。这样就表明荷叶提取物可以作为开发研究的材料来提取出有效的活性抗氧化成分。

2.3 荷叶黄酮抑制豆油氧化能力 由图3可以得出，将不同剂量的荷叶黄酮和BHA加入到豆油中，其过氧化值（POV）都要比对照组低，这就表明荷叶黄酮能够有效的抑制豆油在自然条件下的自动氧化，能够表现出较强的抗氧化能力。但是相对于BHA来说，其抗氧化能力稍微有点不足，可能是因为荷叶黄酮的有效活性成分不纯，导致效果没有BHA好。如果对提取物进一步提纯，其抗氧化效果可能会更有效。

3 结论与讨论

本试验通过采用对荷叶黄酮进行体外的抗氧化活性研究，并和已知的常用抗氧化剂维生素C和芦丁进行对照，说明荷叶提取物具有一定的抗氧化能力，并且随着用量的增大，其表现出较好的抗氧化效果，呈现出一定的量效关系。

以·OH自由基清除法、DPPH·自由基清除法、抑制油脂过氧化能力法和抑制Fe2+诱发脂蛋白过氧化能力法分别探究荷叶黄酮的抗氧化效果发现：荷叶提取物对·OH自由基和DPPH·自由基均具有较强的抗氧化效果，表明荷叶提取物具有较强的还原能力和清除自由基的能力。荷叶取物对抑制脂质的自动氧化和抑制Fe2+诱发脂蛋白过氧化也表现出较强的抗脂质过氧化的作用。而且随着荷叶黄酮用量的增加，其抗氧化活性也随之增强。

通过将荷叶黄酮与日常使用的强抗氧化剂维生素C、BHA和芦丁进行对照比较，表明荷叶提取物具有较强的抗氧化效果和清除自由基的能力。目前，市场上销售的大部分为人工合成的抗氧化剂，其使用过多会对人体产生一定的危害，而荷叶黄酮中的抗氧化活性成分主要为黄酮类化合物，是一种天然的有效的抗氧化剂。因此，将荷叶黄酮应用到食品、医药、抗氧化剂等研发领域中具有广阔的前景。

参考文献

[1]蔡为荣.微波提取荷叶黄酮及其清除羟基自由基的研究[J].食品科学，2004，25（9）：112-114.

[2]杜力军，孙虹.荷叶大豆及其合剂调脂活性部位的研究[J].中草药，2000，31（7）：526-529.

[3]陈海光，余以刚.荷叶黄酮及生物碱的提取工艺研究[J].食品科学，2002，23（1）：69-72.

[4]纪丽莲.荷叶中抑菌成分的提取及其抑菌活性的研究[J].食品科学，1998，8：64-66.

[5]唐裕芳，张妙玲，刘忠义，等.荷叶研究现状与展望[J].食品研究与开发，2004，4（25）：15-18.

[6]汪秋安.天然黄酮类化合物的抗氧化活性和提取技术研究进展[J].化工生产与技术，2004，11（5）：29-32.

[7]张昊，任发政.羟基和超氧自由基的检测研究进展[J].光谱学与光谱分析，2009，29（4）：1094-1105.

[8]颜军，苟小军等.分光光度法测定Fenton反应产生的羟基自由基[J].成都大学学报（自然科学版），2009，28（2）：91-95.

[9]张蕾，乔旭光.荷叶黄酮对油脂抗氧化作用研究[J].粮食与油脂，2009，（5）：19-21.

[10]张尔贤，俞丽君.Fe2+诱发脂蛋白PUFA过氧化体系及对若干天然产物抗氧化作用的评价[J].生物化学与生物物理学报，1996，28（2）：218-221.

（责编：张长青）