树木叶片叶绿素含量三种测定方法的比较*

马宗琪　崔　静　王　秀　刁润洁　傅雁春　杨　文　王修顺　邱念伟（曲阜师范大学生命科学学院， 山东　曲阜　273165）

树木叶片叶绿素含量三种测定方法的比较*

马宗琪崔静王秀刁润洁傅雁春杨文王修顺邱念伟**
（曲阜师范大学生命科学学院， 山东曲阜273165）

丙酮浸提法测定油松和杨树叶片叶绿素含量比丙酮研磨提取法和二甲基亚砜-丙酮两步快速提取法偏低10%～30%；叶绿素a/b比也存在一定差异。而对于小麦和油菜三种方法测定结果基本一致。树木叶片叶绿素含量结果偏低的主要原因是丙酮浸提后的叶片材料中仍有少量褐色（杨树）或浅黄色物质（油松）。上述残余材料中的色素在65℃下用二甲基亚砜再次浸提，或者常温下用二甲基亚砜进行研磨提取，测定吸光度发现上述残余材料中的色素对叶绿素a和b的吸光度具有显著干扰，导致吸光度增大，测定结果偏高。丙酮浸提法不会将干扰物质溶出，或者溶出较少，叶绿素含量测定最为准确，适合含有次生有色物质的树木叶片的叶绿素含量测定。

树木；叶片；叶绿素含量；次生代谢物；丙酮；二甲基亚砜

叶绿素含量是反映树木健康状况的最常用的生理指标之一。能够用来提取叶绿素的有机溶剂，如氯仿、石油醚、二甲基甲酰胺、乙醇、丙酮、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）等［1-3］。其中80%丙酮提取测定法最为常用。因为叶绿素在80%丙酮溶液中的溶解度最大；80%丙酮还能减少丙酮的挥发，加快植物材料尤其是干材料中叶绿素的提取速度，也可以避免材料中的水分影响吸光度［3］。该方法最早由Arnon于1949年提出，后经陈毓荃、Lichtenthaler、段光明等人修正，在大部分实验教材和参考文献中广泛应用［4-6］。80%丙酮提取叶绿素大多采用研磨法，提取过程复杂繁琐，需要经过称重、研磨、洗涤、过滤、定容等步骤，植物材料和试剂的用量都较大，不适合大批样品的测定［7，8］。提取过程中，由于提取容器、研钵、滤纸等黏附叶绿素会造成叶绿素测定结果偏低［7，9］。2010年舒展等人发明了绿色组织80%丙酮直接浸提法［8］，该方法大大减小了实验工作量，节省了试剂和植物材料的用量，但提取时间过长。为提高提取速度，本实验发明了DMSO-80%丙酮两步快速提取法［10］，在用上述方法测定树木叶绿素含量时发现，3种测定方法测定结果差异较大。本文系统分析了树木叶片叶绿素含量测定误差产生的原因，确定了树木叶片叶绿素含量测定的最优方案。

1　材料与方法

1.1实验材料

采用小麦（Triticum aestivum）、油菜（Brassicacampestris）、油松 （Pinus tabuiaeformis）、毛白杨（Populus tomentosa）等4种植物的叶片为实验材料，比较和筛选适合树木叶片叶绿素含量测定的方法。其中小麦和油菜叶片用于分析三种测定方法差异性产生的原因。

1.2提取方法

1.2.180%丙酮直接浸提法（以下简称浸提法）

用直径为0.9cm的打孔器将小麦、油菜、杨树等植物的叶片钻取2个叶圆片，切成宽度为1mm的细丝；油松针叶称取100mg，切成1mm的小段。上述材料放入10mL具塞试管中，直接用10mL 80%丙酮4℃下暗处浸泡提取一周，至叶片无色或白色，然后测定叶绿素溶液在663.6nm、646.6nm处的吸光度。

1.2.280%丙酮研磨提取法（以下简称研磨法）

按1.2.1的方法钻取叶圆片10片，或称取油松针叶0.5g，置于预冷的研钵中，加入少许CaCO3和石英砂，用少量预冷80%丙酮充分研磨后过滤，再用少量80%丙酮洗涤研钵、研棒、残渣和滤纸，并再次过滤，合并滤液于50mL容量瓶中，定容至50mL备用，然后测定663.6nm、646.6nm处的吸光度。

1.2.3两步快速浸提法（以下简称两步法）

按1.2.1的方法将植物材料放入10mL具塞试管中，先用2mL DMSO 65℃下避光提取至叶片完全褪色（约需0.5～3 h），然后用8mL 80%丙酮稀释并混匀，然后测定663.6nm、646.6nm处的吸光度。

1.3叶绿素含量计算

浸提法和研磨法用Porra等人（1989）的修订公式［3］计算叶绿素浓度：Ca（mg/L）=12.25A663.6-2.55A646.6；Cb（mg/L）=20.31A646.6-4.91A663.6，CT=Ca+Cb。两步法用邱念伟等人（2016）推导的矫正公式［10］计算叶绿素浓度：Ca（mg/L）=12.27A663.6-2.52A646.6；Cb（mg/L）=20.10A646.6-4.92A663.6；CT=Ca+Cb。

2　结果与分析

2.1三种方法测定叶绿素含量的结果比较

在研究叶绿素快速提取与精密测定实验中（邱念伟等2016），我们以同等质量或面积的植物材料，分别用三种方法提取叶绿素，测定663.6nm、646.6nm处的吸光度后，代入各自的叶绿素含量计算公式，发现三种方法测定小麦、油菜的叶绿素含量，叶绿素总含量和叶绿素a/b相差不大。但是杨树叶片和松树叶片叶绿素含量差异极大，用丙酮浸提法测定的杨树叶绿素含量比两步法和研磨法分别低28.3%和25.9%；而松树分别低18.4%和13.2%。三种测定方法测定结果差异较大，影响实验结果的可靠性。分析这一差异产生的原因，对准确测定树木叶片的叶绿素含量具有重要意义。

表1　三种提取方法提取测定叶绿素含量结果的比较

2.2丙酮浸提法浸提时间对实验结果的影响

丙酮浸提法测定树木叶片的叶绿素含量结果偏低很有可能是由于浸提时间不够，提取不完全导致。为此，我们取同等质量或面积的植物材料，放入具塞试管中，用10mL 80%丙酮在4℃下浸提不同时间，测定叶绿素含量的变化。结果显示4种植物叶片的叶绿素含量大约在2～4天内被完全提取，超过4天，叶绿素含量不再增加，说明叶绿素已经提取完全。杨树叶片用80%丙酮浸提了7天，所以浸提法测定结果偏低不是由于提取时间短，叶绿素未完全提取造成的。

图1　四种植物叶片80%丙酮浸提法提取时间

2.3丙酮浸提法浸提过程中叶绿素的降解

由于丙酮浸提法需要时间过长，其测定结果偏低也有可能是长时间提取过程中叶绿素降解造成的。我们将上述材料完全提取的叶绿素溶液放置在4℃冷藏冰箱中保存1～7天，每天测定叶绿素浓度变化，计算叶绿素含量，观察叶绿素降解情况。叶绿素溶液在4℃下保存7天后，仅有微弱的降解。杨树和油松叶绿素含量分别仅下降了2.86% 和2.37%。而浸提法测定结果比研磨法或两步法低13%～28%（表1）。

表2　叶绿素在低温提取过程中的降解

2.4丙酮浸提法提取残渣的颜色

叶绿素是否从叶片中完全提取，可以从提取残渣的颜色进行判断。小麦和油菜用三种方法提取后，残渣呈白色半透明状或白色粉末（表3），说明这两种植物的叶绿素已被完全提取。但杨树用80%丙酮浸提7天后，残渣仍然呈褐色；油松的残渣则呈浅黄色。用两步法或研磨法提取杨树和油松的叶绿素，残渣则为白色半透明状或白色粉末。浸提法的残渣再用DMSO 65℃高温提取，并无绿色物质溶出，也证明浸提法可以将叶绿素完全溶出，残渣中已无叶绿素。根据上述现象，我们推测，浸提法残渣中的有色物质可被DMSO高温提取或者研磨提取，从而可能会对叶绿素a和b的吸光度具有显著干扰，导致两步法和研磨法吸光度测定结果偏大。

表3　三种提取方法提取叶绿素后叶片残渣的颜色

2.5丙酮浸提法提取残渣中有色物质的溶出及其对叶绿素吸光度的干扰

浸提法的杨树叶片残渣中的褐色物质用DMSO高温65℃下浸提，褐色物质仍然无法溶出；但在高温65℃下DMSO能溶出松树残渣中的黄色素，使油松残渣变白。将杨树的褐色残渣用DMSO研磨提取，则能溶解出部分褐色物质，残渣变成浅褐色粉末。将两种树木叶片的有色残渣按照上述两种办法分别用DMSO提取，然后再用80%丙酮稀释。DMSO和80%丙酮的用量与叶片样品完全一致，然后测定有色干扰物质在663.6nm和646.6nm处的吸光度。表4结果显示，残渣的有色提取物在663.6nm和646.6nm处有显著的光吸收，其对叶绿素a和叶绿素b的干扰值与两步法及研磨法的吸光度偏大值比较接近。说明两步法和研磨法叶绿素测定结果偏大主要是由残渣中有色物质所造成。因此杨树叶片或油松叶片的叶绿素含量测定用丙酮浸提法更为准确。两种有色物质的吸光度与两步法及研磨法的吸光度偏大值并不完全一致可能是因为干扰物质在不同条件下溶出量不同所致。

3　讨　论

3.1本文在论证两步快速提取法的可行性时发现，研磨法和两步法测定杨树和油松叶片的叶绿素含量比丙酮浸提法高13%～28%，如此大的误差会显著影响实验结果可靠性［10］。系统分析了这一误差产生的原因，为树木叶片叶绿素含量测定选择合适的方法提供参考。

3.2实验结果显示，丙酮浸提法可以充分提取叶片中的叶绿素，长时间浸提过程虽有少量叶绿素的降解，但不足以引起叶绿素含量的大幅度降低。但浸提法提取叶绿素的叶片残渣中有明显的有色物质，杨树叶片残渣呈褐色，油松叶片残渣呈浅黄色。两种叶片残渣中的有色物质可用DMSO高温提取或者DMSO研磨提取，它们在663.6nm和646.6nm处的吸光度与两步法和研磨法的吸光度偏大值相接近。因此可以推断两步法和研磨法测定结果偏大主要是由于树木叶片中的有色次生物质对叶绿素吸光度有明显干扰。

3.3这些有色物质的成分还不清楚，李春媛等报道杨树叶片中含有大量的酚类化合物［11］，酚类化合物氧化可以变成褐色的醌，可以使杨树具有抗病、抗虫、抗低温及抗强光的能力。醌类常温下难微溶水，高温下可增加溶解度，可能是两步法测定结果偏高的原因；研磨法也有助于酚类的溶出，对叶绿素吸光度造成干扰。因此推测杨树叶片残渣中的褐色物质可能是醌类。醌可能是在提取过程中有酚类氧化产生，也可能在叶片中已经产生，因为杨树叶片呈深绿色。松树叶片中含有大量的松脂，松脂中的松香为微黄色，属于萜类化合物，松针残渣中的黄色物质有可能是松脂［12］。因此，凡是含有类似有色次生代谢物质的叶片，其叶绿素含量测定最好用80%丙酮直接浸提法，以减少此类物质溶出，减小其对叶绿素吸光度的干扰，提高测定结果准确性和可靠性。

表4　浸提法提取残渣中有色物质对叶绿素吸光度的干扰

［1］苏正淑，张宪政.几种测定植物叶绿素含量的方法比较［J］.植物生理学通讯，1989，25（7）：75-78.

［2］Wellburn AR.Thespectral determination ofchlorophyllsa and b，aswellastotalcarotenoids，using varioussolventswithspectrophotometers of different resolution［J］.J Plant Physiol，1994，144（3）：307-313.

［3］Porra RJ.Thechequered history of the development and use ofsimultaneousequationsfortheaccuratedeterminationofchlorophylls a and b［J］.Photosyn Res，2002，73（1-3）：149-156.

［4］陈毓荃.关于叶绿素的定量测定（分光光度法）中计算系数的修改意见［J］.西北农业大学学报，1986，14（1）：84-85.

［5］Lichtenthaler HK.Chlorophylls andcarotenoids：Pigments of photosynthetic biomenbranes［J］.Meth Enzymol，1987，148：350-382.

［6］段光明.叶绿素含量测定中Arnon公式的推导［J］.植物生理学通讯，1992，28（3）：221-222.

［7］张其德.测定叶绿素的几种方法［J］.植物学通报，1985，3 （5）：60-64.

［8］舒展，张晓素，陈娟，等.叶绿素含量测定的简化［J］.植物生理学通讯，2010，46（4）：399-402.

［9］许大全.叶绿素含量的测定及其应用中的几个问题［J］.植物生理学通讯，2009，45（9）：896-898.

［10］邱念伟，王修顺，杨发斌，等.叶绿素的快速提取与精密测定［J］.植物学报，2016（印刷中）.

［11］李春媛，王洋，于文喜.杨树酚类物质对春季温度骤降的响应［J］.东北林业大学学报，2009，37（5）：4-6.

［12］宋湛谦，梁志勤，刘星，等.中国油松组松树松脂的化学特征［J］.林产化学与工业，1993，13（2）：97-102.

第1作者简介：马宗琪（1964-），男，实验师，研究方向：植物生理学实验技术。

（责任编辑：张亚楠）

Comparativestudy on threemethods ofchlorophyllcontent Determination of Tree Leaves

MA Zongqi
（College of Lifescience，Qufu Normal University，ShandongQufu273165）

Our results in this papershowed thatchlorophyllcontent of Pinus trees and Populus trees determined by direct extractionmethod with acetone was lower 10%～30%than that of the grindingmethod with acetone or two-step extraction with dimethylsulfoxide（DMSO）and acetone.The ratio ofchlorophyll a tochlorophyll b also had obvious variability among the threemethods.However，there was no obvious difference among threemethod inchlorophyllcontent of wheat and rape.Small amount of brownsubstance in Populus trees leaves and yellowsubstance in Pinus trees leaves were themaincauses resulting in the lowchlorophyllcontent determined by direct extractionmethod.The residualsubstance in above plantmaterial were extracted with DMSO at 65℃or extracted with DMSO by grindingmethod，and their absorbance at 663.6nm，646.6nm weremeasured.The absorbance resultsshowed that the residualsubstance in leaves had obvious interference on the absorbance ofchlorophyll a andchlorophyll b，which results in an increase ofchlorophyll absorbance andmeasured results.Thecoloredsecondarysubstancescould not be extracted by direct extractionmethod with acetone，or little be extracted.So themeasured results ofchlorophyllcontent by direct extractionmethod with acetone is themost accuratemethod among the threemethods.Chlorophyllcontent of tree leaves withcoloredsecondarysubstancesshould be determined using birect extractionmethod.

Tree；Leaf；Chlorophyllcontent；Secondarysubstances；Acetone；DMSO

S718.43，Q945.11

A

1001-9499（2016）05-0042-04

邱念伟（1976-），男，副教授，研究方向：植物光合作用。

2016-07-20

* 山东自然科学基金（ZR2015DL009）；曲阜师范大学实验教改项目（SJ201409）和国家级大学生创新创业训练计划项目（201510446053）资助