不同剂量脂多糖对新生SD大鼠的影响

施　展　刘颖颖　武　荣扬州大学医学院附属淮安市妇幼保健院新生儿医学实验室，江苏淮安223002

不同剂量脂多糖对新生SD大鼠的影响

施展刘颖颖武荣▲
扬州大学医学院附属淮安市妇幼保健院新生儿医学实验室，江苏淮安223002

目的观察腹腔注射不同剂量脂多糖（LPS）对新生SD大鼠的影响。方法将42只新生SD大鼠按随机数字表法分为对照组（n=6）以及实验组（n=12），实验组分别为1 mg/kg组、2 mg/kg组、3 mg/kg组。实验组新生SD大鼠按照1、2、3 mg/kg剂量腹腔注射LPS；对照组给予等量生理盐水。观察24 h各组的一般情况、测定肺组织湿重/干重（W/D）比值，肺损伤病理评分，观察肺组织大体病理情况及肺组织病理学改变。结果注射LPS 24 h时，对照组肺结构完整、肺泡腔干净、肺泡隔无水肿和炎性细胞浸润，实验组病理切片可见炎症细胞浸润、肺泡壁和肺间质的水肿；各组24 h死亡数分别是0、0、0和4，4组死亡数比较，差异有统计学意义（χ2=7.174，P＜0.05）；实验组肺组织损伤评分［（1.91±0.10）、（2.80±0.11）、（5.28±0.39）分］、W/D比值［（1.77±0.07）、（2.98±0.26）、（4.77±0.21）］明显高于对照组［（0.71±0.80）分、（1.49±0.21）］，4组在肺组织损伤评分的两两比较，差异均有统计学意义（F= 699.761，P＜0.05）。4组在W/D比值的两两比较，除了对照组和1 mg/kg组比较差异无统计学意义（P＞0.05），其他各组差异均有统计学意义（F=587.936，P＜0.05）。结论给予新生SD大鼠腹腔注射不同剂量LPS（2 mg/kg和3 mg/kg）24 h内均可制作ALI模型。其中2 mg/kg诱导的大鼠肺损伤模型死亡率低，可以大量、快速地建模。

脂多糖；肺损伤；模型；新生鼠

［Abstract］Objective To observe the effect of newborn SD rats by intraperitoneal injection in different doses of lipopolysaccharide（LPS）.Methods 42 newborn Sprague-Dawley（SD）rats were divided into the control group（n=6）and the experiment groups（n=12）according to the random number table method.The experiment groups were divided 1 mg/kg group，2mg/kg group and 3mg/kg group；the experiment groups intraperitoneal injection of 1 mg/kg，2 mg/kg and 3 mg/kg LPS respectively；the control group were received the same volume saline injection.The general situation，wet weight/dry（W/D）weight ratio of lung，lung injury score and pathological changes of lung tissue at 24 hours in each group were observed.Results 24 hours after LPS injection，the control group lung structure was intact，alveolar cavity was clean，no edema and inflammatory cell infiltration were exist，the experiment group lung inflammatoty cell infiltration and interstitial edema were found；The mortality of groups at 24h were 0，0，0，4；There was significant differences in mortality between the control group and the experiment group（χ2=7.174，P＜0.05）；At experiment groups，the lung injury score［（1.91±0.10），（2.80±0.11），（5.28±0.39）］，the W/D ratios of lung tissue［（1.77±0.07），（2.98±0.26），（4.77± 0.21）］were significantly higher than those in the control group［（0.71±0.80），（1.49±0.21）］.There was significant differences in the lung injury score between the control group and the experiment groups（F=699.761，P＜0.05）.There was significant differences in the W/D ratios of lung tissue between the control group and the experiment groups（F= 587.936，P＜0.05），except for the control group and 1 mg/kg group（P＞0.05）.Conclusion It can be successfully established ALI model of newborn SD rats by intraperitoneal injection of different doses of LPS（2 mg/kg and 3 mg/kg）in 24h.2 mg/kg induced ALI model is with low mortality，it can be used to large and rapid establish ALI model.

［Key words］Lipopolysaccharide；Lung injury；Animal model；Newborn rat

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是各种致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全，流行病学调查显示ALI是临床常见危重症，病死率较高［1］。脂多糖（Lipolysaccharide，LPS）是革兰阴性菌（G-）细胞壁上的一种结构成分，革兰阴性杆菌感染致急性肺损伤，主要是由于LPS活化炎性细胞释放大量炎症因子所致［2］。

根据文献报道［3］，LPS引起肺功能改变在4 h达到顶峰，组织学切片显示主要的特征是炎症细胞浸润和肺泡隔增厚，在2 h显现，并在24 h达到峰值。因此造模时间最好限制在24 h内，此阶段是肺损伤炎症阶段的高峰期，而在此之后大多数ALI动物模型肺部炎症基本消退。

1　材料与方法

1.1实验动物

健康清洁级SD大鼠42只，日龄10 d，体重（18±2）g，雌雄各半。由安徽医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：scxk（皖）2011-002。在光照-黑暗各交替12 h，相同温度、湿度条件下，由母鼠自由喂养。

1.2分组及处理

按随机数字表法分为对照组（n=6）和实验组（n= 12）。后者进一步分为1、2、3 mg/kg的亚组。实验组分别给予1、2、3 mg/kg不同剂量的LPS，最后定容为0.2 mL腹腔注射；对照组给予等容量的生理盐水腹腔注射。

1.3药品

LPS（EcoliO55B5）购自美国sigma公司。

随着社会的不断发展，中国的老龄化趋势日益加剧，老龄化问题也成为了人群之中的热点，其中较为突出的问题就是老人的护理问题，作为一名护理本科生，我平时接触最多的就是医院中的病人，而在这其中老人则是一个特殊又普遍的群体，在平常的见习课程中我也会和老人们进行沟通并且对于一些我所观察到的现存护理问题进行思考，在经过了两年的见习课程后，我有了更多的收获。所以在这里，我想要把我自己护理见习的体会和建议记录下来，同时希望自己在将来养老问题的解决上做一点贡献。

1.4动物样品收集

于24 h时观察成活率并处死，立即打开胸腔，取右肺上叶做组织学检查。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.5肺组织病理观察

1.5.1大体观察按照文献方法分为5级［7］：Ⅰ级，正常肺；Ⅱ级，肺较饱满，有水肿；Ⅲ级，点状肺出血，整个肺可见针尖或绿豆大小的出血；Ⅳ级，局灶性肺出血，肺表面有总面积小于2叶的小灶或小片状出血；Ⅴ级，弥散性肺出血，肺表面可见总面积达2叶以上的斑块状或大片状暗红色出血。

1.5.2组织学检查取右肺上叶组织，经固定、脱水、包埋、切片、HE染色后，光镜下观察。主要依据炎症细胞浸润、肺泡水肿、肺间质水肿、肺泡出血、透明膜形成、肺不张等的程度累计总分，按程度的“无、轻、中、重”分别计“0、1、2、3分”。每只动物分别切取4张切片，每张切片观察不重叠的10个视野，分别记录病理学评分的值［8］。4张切片的平均值即代表该大鼠的病理学评分。

1.6肺组织湿重/干重（W/D）比值测定

取右肺上叶称湿重（W）后，放置80℃恒温烤箱进行48 h烘烤，再称干重（D），计算湿/干重（W/D）比值。

1.7统计学方法

采用SPSS 17.0对所有数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。计数资料采用χ2检验或Fisher精确概率，多组间计量资料比较采用One-way ANOVA分析，方差齐时，两两比较使用LSD检验，方差不齐时，用Tamhane′s T检验进行组间比较。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1呼吸频率及死亡率的变化

动物致伤后出现活动减少、精神萎靡、呼吸急促或呼吸困难等表现，随着LPS剂量增大，呼吸困难程度加重。致伤后6 h，部分动物口鼻偶见血性泡沫。24 h时对照组和1、2 mg/kg组全部成活；3 mg/kg组死亡4只，死亡率为33.3%。4组比较，死亡率差异有统计学意义（P＜0.05）

2.2肺组织大体病理改变

对照组动物肺外观色泽粉红，无明显异常改变。LPS致伤后，肺体积增大，脏层胸膜张力较高，色泽暗红，可见包膜下点、片状出血，切面疏松，有黄色或淡红色液体溢出。LPS剂量越大，新生大鼠肺水肿等病变越重。1 mg/kg组肺大体观察属Ⅱ级；2 mg/kg组肺大体观察属Ⅱ～Ⅲ级；3 mg/kg组肺大体观察属Ⅲ～Ⅳ级，当LPS=3 mg/kg时，易见出血等改变。

2.3组织学检查

对照组动物肺组织HE染色光镜下可见肺结构完整，肺泡腔干净，肺泡隔无水肿和炎性细胞浸润，肺泡壁无增厚；LPS致伤后，主要病变为炎症细胞大量向肺泡腔内渗出；肺间质、肺泡水肿，肺泡隔增厚；肺泡腔及肺间质内红细胞浸润、粉红色液体渗出。当LPS 1、2 mg/kg时，可见炎性细胞渗出逐渐增多、肺泡间隔水肿且逐渐增厚，LPS 1、2 mg/kg组肺组织损伤评分比较，对照组较高（P＜0.05）；当LPS 3 mg/kg时，炎细胞浸润、水肿以及出血等病变均加重，LPS 3 mg/kg组肺组织损伤评分比对照组显著增高（P＜0.05），见图1、表1。

图1　24h时对照组和实验组病理切片HE染色（×400）

表124　 h时肺组织损伤评分和W/D比值的变化（x±s）

2.4肺组织W/D比值的变化

腹腔注射LPS可使新生SD大鼠肺组织W/D比值增加，且肺组织W/D比值随着剂量的增大而增加；LPS=3 mg/kg时，肺组织W/D值显著高于低剂量组。见表1。

3　讨论

急性肺损伤是由多种炎症介质及效应细胞共同参与的，并呈级联放大的瀑布样炎症继发性损伤与继发性弥漫性肺实质损伤。为更好地模拟临床疾病的病理过程以及为进一步研究疾病的病理机制，建立相应的动物模型是非常必要的。ALI的致病因素很多，根据不同诱因，可以复制出不同动物模型。模型动物的可选择种类也相当广泛，包括大鼠、小鼠、兔、犬、猪、绵羊、山羊及灵长类动物等［9］。与其他一些物种相比（如猪、羊），鼠类对LPS高度抵抗，这样大剂量的LPS也必然引起肺部反应［10］。目前诱导成年和新生大鼠肺损伤模型的方法有很多种，如LPS、长期暴露在高氧环境、机械通气、油酸静脉注射、铜绿假单胞菌、病毒感染、硫脲、吸入海水和博来霉素导致ALI等［11］。炎症是急性肺损伤重要的发病机制［12］。G-所致败血症是引发新生儿ALI和死亡的重要原因之一，因此，建立LPS致急性肺损伤模型，为进一步研究打下基础，也对临床ALI防治具有重要意义［13-14］。

本研究结果显示，LPS组可见肺体积增大，可见包膜下大小不等的点、片状出血，切面呈红色肝样变；光镜下主要表现为间质及肺泡腔有广泛出血、水肿、渗出、大量炎性细胞浸润，肺间质和肺泡隔增厚。与相关的研究结果一致［15-16］。肺W/D反映了肺水肿的情况，在本实验中，LPS组肺W/D随剂量的增加逐渐增加，表明肺水肿情况逐渐加重。这也反映了肺血管通透性的改变，表明血管通透性增加，这与肺损伤分子机制中肺间质及肺泡水肿等一致。

在探讨脂多糖致大鼠急性肺损伤模型取材时间中，实验结果提示选择尾静脉注射10 mg/kg脂多糖在6 h时可成功复制大鼠急性肺损伤模型［17］。大鼠尾静脉注射5 mg/kg在2 h时可成功复制大鼠的ALI模型［18］。气管内滴注LPS 8 mg/kg，12 h后亦可建立大鼠ALI模型［19］。气管内灌注LPS 0.5 mL/kg（20 μg/mL）能成功地建立ALI动物模型［20］。何征宇等［21］采用小剂量LPS对小鼠进行连续腹腔注射的方法，成功制作了LPS诱导的小鼠ALI和肺纤维化的动物模型。

本研究发现，梯度剂量LPS可以引发程度不同的新生大鼠ALI。1 mg/kg组炎细胞浸润范围小，无水肿和出血等病变，肺损伤较小，24 h死亡率为0，在24 h内未达到肺损伤的标准，因此不适合作为研究24 h内新生大鼠ALI模型的剂量；3 mg/kg病理显示肺损伤较严重，可见水肿、炎细胞浸润以及出血等病变，肺水含量显著高于低剂量组，24 h死亡率为33.3%，由于死亡率较高，因此也不适合作为研究24 h内新生大鼠ALI模型的剂量；2 mg/kg组肺损伤程度适中，24 h的死亡率为0，适合作为研究24 h内新生大鼠ALI模型的剂量。

综上所述，选用不同剂量LPS（2 mg/kg和3 mg/kg）对新生SD大鼠腹腔注射，在24 h内均可制作ALI模型。其中2 mg/kg剂量诱导的大鼠肺损伤模型死亡率低，可以大量、快速地建模。

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Lipolysaccharide-induced acute lung injury in newborn rats

SHI ZhanLIU YingyingWU Rong▲
Neonatal Medical Laboratory，Huai′an Maternity and Child Healthcare Hospital Affiliated to Yangzhou University Medical Academy，Jiangsu Province，Huai'an 223002，China

R722.1

A

1674-4721（2016）09（a）-0034-04

2016-05-20本文编辑：赵鲁枫）

江苏省妇幼保健重点人才基金项目（FRC201211）。