云南龙竹种子外植体适宜灭菌时间筛选试验

李云海 陈丽华 刘艳

摘要 以云南龙竹的成熟种子为试验材料，采用75%酒精配合0.01%升汞作消毒灭菌剂，并设置0.01%升汞的不同消毒灭菌时间处理的对比。结果表明：在用75%酒精处理15 s后，再用0.01%升汞消毒灭菌处理，其适宜的消毒灭菌处理时间为3 h。在此消毒灭菌时间处理情况下，龙竹种子外植体的污染率已较低，为16.7%；而发芽率仍较高，可达到72.0%。

关键词 云南龙竹；组织培养；种子；外植体；灭菌

中图分类号 S795 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）06-0159-01

竹子因开花周期较长，且开花花期无法预测，种子获取十分困难。因此，采用组织培养技术，对竹子进行快速扩繁，是目前解决竹子种苗繁殖效率低问题的有效方法之一。在组织培养过程中，菌类污染是培养过程中常见且必须高度重视的问题，其污染来源一般可分为3类：第1类是材料带菌，第2类是接种污染，第3类是培养过程污染[1]。因而植物组织培养技术的基础是获得无菌材料，即有效解决材料带菌问题，理论上污染率应该控制在8%以内，但实际操作过程中，一般污染率会达到20%左右，甚至更高。再者，竹类植物与其他植物相比，竹子外植体的消毒灭菌则更困难，很难达到理想的灭菌效果，这可能与它的外在形态结构有关[2]。外植体表面消毒灭菌的关键就是要选择合适的消毒剂和消毒时间，同时还要兼顾消毒灭菌后外植体材料的存活率、生长状况等[3]。

很多学者对于竹子外植体的灭菌普遍采用的方式是以酒精（75%）与升汞（0.05%～0.20%）或次氯酸钠（0.5%～2.0%）配合使用，然后再根据不同的外植体材料情况进行不同时间的灭菌[4]。本试验以云南师范大学竹类研究所提供的云南龙竹（Dendrocalamus yunnanicus Hsuch et D.Z.Li）种子为外植体材料，以MS培养基添加1mg/L 6-BA为起始培养基，进行了酒精（75%）配合升汞不同消毒灭菌时间的比较，以期从中筛选出较适宜龙竹种子外植体的消毒灭菌方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取成熟度和饱满程度较高的云南龙竹健康种子（此种子已干燥储藏超过1年），仔细筛选去除发黑、发霉和结构不完整的种子，剥去外壳且不能伤及胚芽部分，最后留下色泽较好、颗粒饱满且结构完整的种粒备用。

1.2 试验方法

把选好的种粒用75%酒精消毒15 s并用无菌水清洗后，再用0.01%升汞浸泡做不同时间的消毒灭菌处理。所设置的4个不同处理时间分别为2.0、2.5、3.0、3.5 h。处理结束后，分别用无菌水振荡清洗4～5次，每次5～7 min，分别记为处理1、2、3、4。用无菌滤纸吸干种粒上的水分，分别接种到MS+1 mg/L 6-BA+5 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖培养基中。每处理接种6组，每组5个试管，每试管接种1粒种子，共计30粒种子，置于23～25 ℃、光照2 000 lx、光照时间12 h/d条件下培养[5-6]。

观察记载各处理的种子在接种5、10、15、20 d后的污染情况和发芽情况，并对其15 d时的污染情况和20 d时的发芽情况进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 升汞不同消毒灭菌时间处理种子的污染情况

由表1可知，接种15 d后，处理1、2、3、4的污染数分别为2.00、1.67、0.83、0.50粒。经方差（新复极差法）分析，处理1、2、3、4之间的差异极显著，而组间（重复间）差异不显著。进一步的多重比较分析结果（表2）表明，处理1与处理3、4差异都极显著，而与处理2无显著差异；处理2与处理4差异极显著，与处理3差异显著；处理3和处理4差异不显著。结合各处理的污染率可得出，随着消毒时间的增加，其污染程度越来越低，至处理3、4时，污染程度已较低且二者已无显著差异。

2.2 升汞消毒时间对竹子种子外植体发芽情况的影响

由表3可知，接种20 d后，处理1、2、3、4的发芽率分别为94.4%、95.0%、72.0%、44.4%，即随着升汞消毒灭菌时间的增加，各处理的发芽率呈现先增加后降低的趋势，最高达（下转第165页）

95.0%，最低为44.4%。方差分析结果显示，处理2与处理4差异极显著；处理1、3与处理4差异显著；而处理1、2、3之间差异不显著。

3 结论与讨论

本试验以云南龙竹的成熟种子为试验材料，采用75%酒精配合0.01%升汞作消毒灭菌剂，并设置0.01%升汞的不同消毒灭菌时间处理的对比。试验结果表明：在用75%酒精处理15 s后，再用0.01%升汞消毒灭菌处理，随着0.01%升汞消毒灭菌处理时间的增加，各处理的污染率显著降低，而剩余（未污染）种子的发芽率则呈现先升高后又降低的趋势。分析表明，用0.01%升汞对云南龙竹种子进行消毒灭菌处理，其适宜的处理时间为3 h。在此消毒灭菌时间处理情况下，龙竹种子外植体的污染率已较低，为16.7%；而发芽率仍较高，可达到72.0%。而处理时间再增加（如处理3.5 h），则显著影响种子的发芽率（仅为44.4%），污染率却降低不显著。

本试验因为考虑到消毒灭菌剂升汞的较强毒性，因此没有使用其较高浓度（如0.05%～0.20%）来处理外植体材料，以减少用无菌水反复冲洗及升汞本身的毒性对外植体材料的伤害。试验结果也表明，只要达到足够长的灭菌处理时间，较低浓度的升汞也能够显著控制植物外植体材料的污染，且种子等材料的成活和发芽率也能得到保障。特别是那些比较难得到的外植体材料，首先得保障其外植体材料不被杀死，在此基础上才能进一步考虑如何提高杀菌效率。

4 参考文献

[1] 曹雄丽，文韵，陶现灵，等.32种经济竹种的组培及苗木培育技术研究[J].林业调查规划，2012，37（5）：128-134.

[2] 王光萍，丁雨龙，黄敏仁，等.观赏竹的试管快繁研究[J].林业科学，2005，41（5）：51-56.

[3] 李春芳，程治英，杨俊波，等.云南龙竹的快速繁殖和离体保存研究[J].亞热带植物科学，2012，2（3）：60-62.

[4] 高志明，谢锦钟.竹子组织培养技术研究进展[J].世界竹藤通讯，2013，11（2）：1-6.

[5] 耿树香，普晓兰，王曙光.巨龙竹种子、小穗外植体愈伤组织的诱导培养[J].西部林业科学，2006（4）：78-83.

[6] 李云海，陈丽华，杨娟，等.孝顺竹外植体适宜消毒方法及丛芽诱导培养基的筛选[J].云南农业科技，2008（2）：18-19.