循环血miR-21-3p作为脓毒症心肌病的标记物

刘慧，王惠，史倞，孔祥清

（南京医科大学第一附属医院心脏科，南京210029）

循环血miR-21-3p作为脓毒症心肌病的标记物

刘慧，王惠，史倞，孔祥清

（南京医科大学第一附属医院心脏科，南京210029）

已有研究发现微小RNA（microRNAs，miRNAs）可由细胞分泌并释放进入循环系统，在血清、血浆、尿液和其他体液中稳定存在，并可作为非损伤性生物标记物对多种疾病进行早期诊断、鉴别分期、预后判断和疗效监测等.与健康对照者相比，miR-21-3p在22例脓毒症心衰患者血浆中显著升高.通过绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，并分析其与临床参数的相关性发现，miR-21-3p在鉴别脓毒症心衰和健康人群时，曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.949.相关性分析结果显示，血浆miR-21-3p水平与B型脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）（r=0.968，P＜0.001）、心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTNT）（r=0.257，P=0.002）水平呈正相关.因此，外周血中的miR-21-3p有作为脓毒症心肌病的生物标记物的潜力.

脓毒症心肌病；miR-21-3p；循环miRNA

败血症休克是临床上最常见的急危重症，由于至今仍缺乏疗效高、副作用小的治疗方法，因此导致其死亡率较高［1］.细菌感染是脓毒症休克最常见的病因，细菌中的内毒素、外毒素以及细菌外壁成分——脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以刺激相应靶细胞如单核细胞、多形核中性粒白细胞或内皮细胞等，进而启动炎症进程，产生一系列促炎细胞因子（proinflammtory cytokine）［2］.尽管经过10年医疗的不断进步，脓毒症却仍因病情进展迅速、临床救治困难，而成为危重病人死亡的重要原因［3］.在脓毒症早期心血管功能即可发生变化，且与患者预后密切相关，脓毒症并发心血管功能障碍被普遍称为脓毒性心肌病（sepsis-induced cardiomyopathy，SIC）［4-5］.一旦出现心血管并发症，心功能障碍又会加剧脓毒症病情，导致死亡率显著上升，因此脓毒症心功能不全是重症监护室重点监控疾病［6-7］.脓毒症临床治疗措施中很难通过评估脓毒症对心脏、血管、微循环的影响来判断预后.

本课题组前期研究发现，miR-21-3p的表达水平在LPS诱导的脓毒症心肌病中升高，并会加重小鼠的心肌功能障碍，因此本研究旨在探索miR-21-3p是否具有脓毒症心肌病相关生物标记物的诊断潜力，并进一步验证其与临床参数的相关性.

1　材料与方法

1.1标本的收集

所有血液样本来自南京医科大学第一附属医院，包括脓毒症心衰患者22例，健康对照者18例.血液样本的使用已取得患者同意.脓毒症患者在收治入院的24 h内抽取血液样本，2 mL外周血经乙二胺四乙酸（ethylenediaminetraacetic acid，EDTA）抗凝后立即在室温条件下于1 500 g离心力离心15 min，轻轻吸取上清即血浆，移入RNA-Free的EP管中，并于-80°C保存.

1.2血浆RNA的提取

利用Ambion试剂盒提取血浆中的RNA，具体实验步骤参照试剂盒说明书进行.RNA的纯度和浓度采用Nanodrop ND2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）进行检测.

1.3qRT-PCR的检测

血浆中miRNA的逆转录和后续的定量检测采用Bio-Rad公司的miRNA qRT-PCR Detection Kit.miRNA引物购自广州市锐博生物科技有限公司，SYBR Green染料购自美国Bio-Rad公司，在Eppendorf公司Mastercyclerrealplex Real-Time PCR 7900仪器上进行荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测.10µL反应体系如下：Power SYBR Green 5µL，正向引物（10µmol/L）0.5µL，反向引物（10µmol/L）0.5µL（具体序列见表1），cDNA模板0.5µL，去离子水3.5µL.荧光定量PCR具体步骤如下：①95°C 3 min；②95°C 15 s，60°C 30 s，72°C 30 s，本步骤重复40个循环；③反应结束后溶解曲线先加热到95°C，后降至60°C，在20 min内再缓慢升温至95°C，持续15 s，记录荧光信号的变化.荧光定量PCR均重复3次.

1.4统计学分析

两组血浆中miRNA表达水平差异、与临床资料的相关性及诊断价值的评估采用Graph-Pad Prism 5软件进行统计分析，并进行受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线的绘制和曲线下面积（area under the curve，AUC）的计算，以评估目的miRNA的诊断价值，最后通过计算Youden指数（Youden's index）来选择最佳界值（cutoff value）.

2　结果与分析

2.1目的miRNAs检测

本课题组前期研究数据显示，miR-21-3p的表达水平在LPS诱导的脓毒症心肌病中升高，并会加重小鼠的心肌功能障碍，因此对22例脓毒症心衰患者和18例健康对照者血浆中miR-21-3p的表达水平进行检测.qRT-PCR结果显示：miR-21-3p的表达水平在脓毒症心衰患者中显著升高，P＜0.001（见图1）.

图1　miR-21-3p在脓毒症心衰患者和健康对照者血浆中的表达水平对比Fig.1 Plasma levels of miR-21-3p in septic patients with cardiac dysfunction compared with healthy controls

2.2ROC曲线分析

为了进一步评估miR-21-3p作为诊断脓毒症心肌病标记物的价值，本研究利用GraphPad Prism 5软件绘制了ROC曲线，同时计算其AUC，并选择最大Youden指数作为脓毒症心肌病标记物的界值.结果显示，目的miRNAs在区别脓毒症心肌病患者和健康人群时有一定的诊断价值.为了验证目的miRNAs在所有样本中鉴别脓毒症心肌病患者的水平，对所有样本进行ROC曲线的绘制，结果发现miR-21-3p曲线下面积为0.949，灵敏度、特异度、AUC均较高，表现出较高的诊断价值（见图2，P＜0.05）.

图2　ROC曲线Fig.2 ROC curves

2.3miRNAs血浆表达水平与患者临床资料相关性分析

与表1临床资料结合作进一步分析，按临床参数分组对miR-21-3p表达水平进行验证，表1中，WBC代表白细胞（white blood cell），CRP代表C反应蛋白（C-reactive protein），PCT代表降钙素原（procalcitonin），NT-proBNP代表N末端B型脑钠肽前体（N-terminal of the prohormone brain natriuretic peptide），cTNT代表心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T）.Spearman秩相关性分析结果如表2所示，可见miR-21-3p表达水平与血浆中的BNP（r=0.968，P＜0.001）、cTNT（r=0.257，P=0.002）表达水平呈正相关.但miR-21-3p的表达水平与WBC，CRP及PCT无关.

表1　脓毒症心功能不全患者与健康对照临床资料Table 1 Clinical characteristics of sepsis patients with cardiac dysfunction and health control

表2　血浆中miR-21-3p与患者临床资料之间的相关性Table 2 Correlation analyses between plasma miR-21-3p and clinical data

3　讨论

本研究结果表明，循环miR-21-3p能够作为诊断脓毒症心肌功能障碍的生物标记物，有较好的特异度、灵敏度，也具有较好的诊断价值.随着本研究的深入，发现如下现象：①miR-21-3p表达水平在脓毒症心衰患者血浆中显著升高；②绘制ROC曲线人群鉴别时，通过相关性分析发现血浆miR-21-3p表达水平灵敏度、特异度、AUC较高，表现出较高的诊断价值，提示这种miRNA在脓毒症导致的心功能转变过程中可能发挥重要作用.

近期研究发现，循环中的miRNA有着作为脓毒症早期诊断标记物的潜力.已有报道指出，在脓毒症患者外周血中miR-146a和miR-223的表达水平明显下降，可将脓毒症与其他非感染性引起的全身炎症反应综合症区分开［8-9］.miR-150与细菌感染和炎症反应密切相关，Roderburg等［10］在脓毒症病人的血清中检测到miR-150表达水平降低，并提示不良预后.为了进一步研究循环miRNA作为脓毒症生物标记物的潜在价值，研究者在小鼠盲肠结扎穿刺模型中进行miRNA筛查，发现miR-16，miR-17，miR-20a，miR-20b，miR-26a，miR-26b，miR-106a，miR-106b，miR-195和miR-451表达水平升高.提取exosome后发现，miR-16，miR-17，miR-20a，miR-20b，miR-26a和miR-26b表达水平在exosome中显著升高，提示循环miRNAs可能存在于体液的exosome中，并稳定存在［11-12］.相似地，Tacke等［13］在动物模型中筛选并发现了miR-133a，miR-150，miR-155，miR-193b表达水平的变化，并在脓毒症和非脓毒症患者血液中进行验证，发现miR-133a表达水平的升高与细菌感染炎症相关.除了miR-133a，近期研究还证实了miR-574-5p作为脓毒症生物标记物有一定的诊断价值［14］.

目前，对于miR-21-3p在脓毒症心肌病中的作用知之甚少.近期研究发现miR-21-3p的表达水平在LPS诱导心肌功能障碍中升高，并通过影响心肌收缩、自噬影响心脏功能［15］.这种miRNA在败血病的发展过程中，由心脏组织释放进入血液循环，稳定地存在并表达，为在外周血中检测循环miRNA从而筛查脓毒症心肌病提供了可能.

本研究发现并证实了miR-21-3p具有作为脓毒症心肌病生物标记物的潜力，具有较高的灵敏度、特异性.本研究纳入22例SIC患者血浆样本，并且所得数据显示出了较好的诊断价值趋势，但还有待更大样本量的实验来进一步证实.本研究探索了无创性诊断脓毒症心肌病的标记物领域，为后续更大范围和规模的研究提供了重要的参考.

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Circulating miR-21-3p as biomarkers for sepsis-induced cardiomyopathy

LIU Hui，WANG Hui，SHI Jing，KONG Xiangqing
（Department of Cardiology，First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

Recently，microRNAs（miRNAs）are found to be abundantly present in body fluids including plasma and serum，and called circulating miRNAs.Increasing evidences suggest that circulating miRNAs may be useful as stable blood-based biomarkers in sepsis. Serum miR-21-3p is significantly increased in septic patients compared with healthy controls.Receiver operating characteristic（ROC）curve analyses suggest that these plasma miR-21-3p may be useful biomarkers for discriminating patients with sepsis-induced cardiomyopathy（SIC）from healthy controls.miR-21-3p yields the ROC area under the curve（AUC）of 0.949.Further analyses indicate that the expression level of miR-21-3p is correlated with the brain natriuretic peptide（BNP）（r=0.968，P＜0.001）and cardiac troponin T（cTNT）level（r=0.257，P=0.002）.Serum miR-21-3p may serve as new biomarkers for sepsis with high specificity and sensitivity.

sepsis-induced cardiomyopathy（SIC）；miR-21-3p；circulating miRNAs

R631

A

1007-2861（2016）03-0366-05

10.3969/j.issn.1007-2861.2016.03.019

2016-04-22

国家自然科学基金资助项目（81570247）

孔祥清（1966—），男，教授，主任医师，博士生导师，博士，研究方向为先天性心脏病介入治疗.

E-mail：xiangqingkong nj@163.com