36种中草药提取物对烟草赤星病菌的抑制作用

袁圆 桑维钧 石春发 刁朝强 王德凤 刘宁国 崔庆彩

摘要： 对36种中草药分别进行微波法提取及水蒸气蒸馏法提取，以烟草赤星病菌（Alternaria alternate）

为供试菌种，采用菌丝生长速率法对其提取物进行抑菌作用研究。结果表明，两种方法的提取物对烟草赤星病菌基本都有抑制作用。其中，在微波法中，黄连和雄黄的提取物初步抑制作用最好，抑制率分别为91.15%和76.72%，桑寄生、甘草和白果在60%以上。在室内毒力测定研究中，黄连和雄黄的EC50分别为7.077 3 mg/mL和140.651 3 mg/mL。在水蒸气蒸馏法中，抑菌作用最强的是大黄、七叶一枝花和肉桂，抑制率均在60%以上，分别为69.93%、68.14%和63.07%。

关键词： 中草药； 提取物； 烟草赤星病菌（Alternaria alternate）

中图分类号：S432.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）05-1159-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.018

The Inhibitory Effects Thirty-six Herbal Medicine Extracts against Alternaria alternate

YUAN Yuan1a，SANG Wei-jun1b，SHI Chun-fa1a，DIAO Zhao-qiang2，WANG De-feng1a，LIU Ning-guo1a，CUI Qing-cai1a

（1a.College of Agriculture；b.College of Tobacco，Guizhou University，Guiyang 550025，China；

2.Guiyang Prefecture Branch，Guizhou Tobacco Company，Guiyang 550001，China）

Abstract：36 kinds of herbs were respectively extracted with microwave and steam distillation， the inhibition of which was carried out by mycelial growth rate method with Alternaria alternate as the test object. The results showed that the extracts of the two methods had inhibitory effects on A.Alternate. The best preliminary inhibitory effects were rhizoma coptidis and realgar of the microwave method， their inhibition rate were 91.15% and 76.72% respectively， the mulberry parasitism， liquorice and gingko were above 60%. In the study of indoor toxicity measurement，EC50 of rhizoma coptidis and realgar were 7.077 3 mg/mL and 140.651 3 mg/mL. In the water vapour distillation， the strongest inhibitions were rhubarb， paris polyphylla and cinnamon， whose inhibition rate were over 60%，69.93%，68.14% and 63.07% respectively.

Key words： herbal extracts； Alternaria alternate； inhibitory effects

煙草赤星病的病原是链格孢菌[Alternaria alternate（Fries） Keissler]，该病主要发生在大田生长后期[1]，是危害中国烟草生产的一种重要真菌性病害[2，3]。贵州省主要烟区分布在兴义、威宁、六盘水、毕节、大方、遵义等地。烟草赤星病的流行对烟叶产量及质量产生严重影响，降低了烟叶商品的市场竞争力，常常给烟叶的生产带来巨大的经济损失。目前防治烟草赤星病的有效措施主要是化学防治，但是由于长时间使用化学合成农药，不仅破坏了生态环境，而且还增加了烟叶的农药残留毒性。

中国中草药资源丰富，目前已发现有杀菌活性的植物约有1 400余种，且发现在对人体致病菌有抑制作用的中草药中，有些对植物病原菌也有很好抑制作用[4]。在小麦上，卢巴子、鸡冠花和月季花等7种中草药的乙醇提取物对小麦赤霉菌有明显的抑制作用，其中鸡冠花的抑菌率达100%[5]。丁香的丙酮提取液对小麦赤霉病菌和小麦纹枯病菌抑制率为100%，虎杖对小麦赤霉病菌和小麦纹枯病菌抑制率均在80%以上[6]。目前，已有很多关于中草药抑菌方面的研究，但是在烟草赤星病上的报道较少。为此，本试验选取36种药性各异的中草药分别进行微波法和水蒸气蒸馏法提取，采用生长速率法对其提取物进行室内抑制作用测定，旨在筛选出有效防治烟草赤星病的中草药，为生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 烟草赤星病菌于2014年6月在清镇市烟草基地采集典型病株，在贵州大学农学院植物病理实验室分离纯化保存。

1.1.2 供试中草药 2014年7月购于贵阳市花果园鑫发药业（表1）。

1.2 方法

1.2.1 提取物制备

1）微波法。中草药于45 ℃条件下烘干，用粉碎机粉碎，过40目筛，准确称取10 g溶于100 mL去离子水中，浸泡振荡30 min，置微波中火（450 W）5 min，冷却至室温，重复一次，两层滤纸抽滤，滤液于旋转蒸发仪中50 ℃减压浓缩，在常温下定容至10 mL，即浓度为1 g/mL。4 ℃储存备用。

2）水蒸气蒸馏法。中草药于45 ℃条件下烘干，用粉碎机粉碎，过40目筛，准确称取10 g溶于50 mL去离子水中，浸泡30 min，置于水蒸气蒸馏装置中反应30 min，收集其蒸馏物，于4 ℃储存备用。

1.2.2 中草药提取物的抑菌作用试验 采用生长速率法测定中草药提取物对烟草赤星病菌菌丝生长的抑制作用[7]。将中草药提取液与PDA培养基以1∶9的比例混匀后倒入培养皿，每个药液3次重复，以去离子水为对照。用5 mm的打孔器沿着菌种同一个圆周打孔，用接种针小心将供试菌种接到含药培养基上，菌丝面朝下，每皿一块。于25 ℃恒温箱中培养7 d。用十字交叉法测量菌落直径，取平均值，计算抑制率。

相对抑制率=■×100%

（注：处理菌落直径为减去原菌饼直径5 mm后的值）

1.2.3 中草药提取物室内毒力测定 将抑制率在70%以上的中草药提取液浓度合理划分为3.125～50.000 mg/mL共5个梯度，每个浓度梯度3次重复，以去离子水为对照。按照“1.2.2”中的接种及培养方法，测量其直径，计算抑制率。

1.2.4 数据处理及分析 将生长抑制率转换成抑制机率值，用药剂浓度的对数和抑制机率值计算毒力回归方程、抑制中浓度（EC50）及相关系数R，采用Excel和DPS处理相关数据。

2 结果与分析

2.1 中草药提取物对烟草赤星病菌的抑制作用

中草药微波法提取物对烟草赤星病菌的抑制作用结果见表2。由表2可知，36种中草药提取液对烟草赤星病菌均有不同程度的抑制作用。抑制作用最好的是黄连和雄黄，抑制率分别为91.15%和76.72%；抑制率在60%以上的还有桑寄生、甘草和白果；还有6种提取液抑制率在50%以上。

中草药水蒸气蒸馏法提取物对烟草赤星病菌的抑制作用结果见表3。36种中草药提取物对烟草赤星病菌均有不同程度的抑制作用。大黄、七叶一枝花和肉桂的抑制率分别为69.93%、68.14%和63.07%。其余除白豆蔻之外的抑制率均在50%以下。其中肉豆蔻的提取液对烟草赤星病病菌菌丝生长有促进作用。

2.2 中草药提取物对病菌的室内毒力测定

根据中草药提取物对烟草赤星病菌抑制效果分析，可知微波法提取的黄连和雄黄提取液对烟草赤星病菌的抑制率在70%以上。对这两种提取物进行了室内毒力测定。结果如表4。由表4可知，在微波法中提取物浓度梯度在3.125～50.000 mg/mL时，黃连提取物的抑制率在30.71%～84.82%的范围内波动。而雄黄在相同的浓度范围内，抑制率为17.68%～42.68%。二者提取物抑制率均伴随着浓度的升高而增大。不同的是，雄黄的抑制率的增幅低于黄连，即当雄黄提取物的浓度在50.000 mg/mL时其抑制率还达不到黄连提取物浓度为6.250 mg/mL时的抑制率。

由表5可知，黄连和雄黄提取物在本次毒力测定试验中的相关系数分别为0.975 910和0.945 992。毒力回归方程分别为y=4.034 3+1.136 3x和y=3.652 3+0.627 4x。黄连的抑制中浓度EC50为7.077 3 mg/mL，远低于雄黄的140.651 3 mg/mL。

3 小结与讨论

选用两种提取方法对36种中草药进行处理，将其提取物对烟草赤星病菌进行了室内毒力测定。在微波法提取物浓度为1 g/mL时，筛选出了1种抑制率为91.15%、1种抑制率为76.72%和3种抑制率在60%以上的中草药提取物。在水蒸气蒸馏法中，筛选出抑菌作用在60%以上的中草药提取物3种。

总体上看，本次试验中微波法提取物的抑菌率要高于水蒸气蒸馏法。相比传统的水蒸煮法，微波法操作方便、装置简单、反应时间短、提取率高、试验安全。通过简单的微波加热，可以将中草药的抑菌成分最大程度提取出来。水蒸气蒸馏法适于提取中草药中的挥发性物质、小分子生物碱类及酚类等物质，相对于微波法提取物范围比较狭窄，因此可能在本次研究中抑制作用较弱。另外，由于是室内试验结果，以后还需要进一步进行活体试验研究。本次试验筛选的结果对于防治烟草赤星病提供了理论依据，为以后进一步筛选中草药活性物质奠定了一些理论基础。

参考文献：

[1] 方宇澄.中国烟草病虫害彩色图志[M].合肥：安徽科学技术出版社，1992.

[2] 刘学敏，常 稳，李大壮.烟草赤星病研究现状及存在问题[J].东北农业大学学报，2000，31（1）：80-85.

[3] 张 亚，何可佳，罗 坤，等.烟草赤星病研究进展及对策[J].陕西农业科学，2007（2）：83-84，90.

[4] 严 振，莫小路，王玉生.中草药源农药的研究与应用[J].中国中药杂志，2005，30（21）：1714-1717.

[5] 王树桐，张凤巧，高瑞平，等.126种中草药提取物对2种植物病原真菌的抑制作用[J].河南农业科学，2006（10）：62-66.

[6] 朱立成，刘 文，王祥胜，等.丁香等3种中草药提取物抑制植物病原真菌的研究[J].安徽农业科学，2006，34（21）：5581-5582.

[7] 方中达.植病研究方法[M].第3版.北京：中国农业出版社，1998.