RNA干涉转基因马铃薯对卷叶病毒抗性的研究

龚磊　王舰　杨永智

摘要：利用大田统计方法，结合分子生物学手段和生物信息学手段对转化的23个转基因马铃薯突变株进行抗病性鉴定，分析转化群体中外源基因的插入信息，并利用双夹心抗体酶联免疫法技术研究受侵染后马铃薯卷叶病毒基因在这些转化体中的表达情况。结果表明，一些株系出现了性状突变，通过分子生物手段检测发现大部分株系都有一定的马铃薯卷叶病毒抗性，但是抗性水平差异很大。试验验证了RNA干涉技术策略的可行性。

关键词：马铃薯卷叶病毒； RNA干涉（RNAi）； 酶联免疫检测

中图分类号：S432.4+1；S532 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）08-1994-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.020

Abstract： The field statistical method combined with molecular biology and bioinformatics methods were used to identify potato disease resistance of 23 transgene mutant strains， analyzing the transformation groupss external gene whose inserted information. And the double-direct sandwich ELISA technique was used to study infested potato leaf roll virus gene expression in the transformation of the body. The results showed that some character mutation strain appeared， most of the strains measured by the molecular biological tools had some potato leaf roll virus resistance， but the resistance level difference was big.

Key words： potato leaf roll virus（PLRV）； RNA interference（RNAi）； enzyme-linked immune detection

马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）属黄化病毒组，由蚜虫以持久方式传播，是马铃薯上最重要的病毒病害之一[1]。马铃薯卷叶病毒可侵染马铃薯引起卷叶、黄化、矮缩、僵化及块茎网状坏死等症状，严重影响马铃薯的产量和品质，是一种世界范围的马铃薯重要病害[2-5]。

RNAi是由dsRNA介导的基因沉默现象，是细胞内的一种防御机制，可特异地降解细胞内与之具有同源性的核酸[6]，起到调节细胞内编码基因表达的作用。由于RNAi具有抗病毒表现型为高抗或近似于免疫、抗病性更持久、生物安全性高等优点，具有更加广阔的应用前景[7-10]。因此，探讨利用RNA介导抗性来培育抗病毒转基因马铃薯的这一新策略的可行性和应用价值具有重要的现实意义。

本试验利用大田统计方法结合分子生物学手段和生物信息学手段对青海大学农牧学院实验室转化的23个转基因马铃薯突变株进行抗病性鉴定，整个试验以验证RNA干涉技术策略的可行性，为得到对马铃薯卷叶病毒具有稳定抗性的马铃薯转基因植株提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为青海大学农牧学院实验室转化的23个转基因马铃薯突变株和未转基因对照高原4号和脱毒175以及感染马铃薯卷叶病毒的马铃薯植株PLRV-2、PLRV-4、PLRV-8（表1）。所转入的基因为RNA干涉片段，根据马铃薯卷叶病毒基因开放阅读框设计引物扩增出2个片段，分别命名为PLRV1和PLRV2，大小分别为240 bp和400 bp。通过正向方向插入载体PCADS1341中，再通过根癌农杆菌转入马铃薯植株，通过验证获得转基因材料。

1.2 主要试剂及仪器

主要试剂有十六烷基-三甲基-溴化胺（CTAB）（上海博奥生物科技公司）、PCR试剂（10×Buffer、2.5 mmol/L dNTP、10 μmol/L引物、5 U/μL Taq聚合酶）（Takara）、琼脂糖（Agarose）（Biowest）、Marker2000（Takara）、ELISA试剂盒（Cygnus）。TE（pH 8.0）：分别量取2 mL 1 mol/L的Tris HCL和0.4 mL 0.5 mol/L的EDTA（pH 8.0）加入到150 mL去离子水中，搅拌混匀，加去离子水定容至200 mL，0.1 MPa、120 ℃高压灭菌30 min，备用。

主要仪器有DYY-2C电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、Eppendorf Bio-photometer紫外分光光度计、S1000 Thermal cycle PCR仪（BIO-RAD）、PB303-N电子精密天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]、Versadoc 1000凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）、Eppendorf 5415D台式离心机（德国）、Elx800酶标仪（Bio-tek），其他仪器及耗材均由青海省农林科学院生物所实验室提供。

1.3 大田抗病性试验观察

1.3.1 大田试验 将固体MS培养基中扩繁的小植株在株高4～5 cm時取出，假植于蛭石中，约2周后移入大田。2012年5月15日将转基因材料及病毒株按随机区组法种植于西宁市城北区农林科学院生物所试验田，共25株系，3个重复，病毒株种植于小区间。行距×株距=70 cm×30 cm，小区间距1.5 m，小区宽3 m，长19 m，小区面积57 m2，区组面积171 m2，小区间面积57 m2，共计总面积228 m2。定植前对以上田块进行深翻和施肥。

1.3.2 蚜虫传染马铃薯卷叶病毒试验 2012年6月当转基因株高15 cm时，用带病毒的桃蚜（Myzus persicae Sulz）接种PLRV，每株10头。传毒前先将无毒蚜虫放在感染PLRV的马铃薯上饲毒3 d，传毒5 d后杀死蚜虫，于接种5周后采集上部叶片检测PLRV，用ELISA法和实时定量PCR测定。同时观察叶片是否有典型的卷叶病特征。

1.3.3 大田植株表型观察 2012年7月13日在试验田进行表型统计，对叶片的形状、颜色、株高、花期进行观察并分析是否有表型突变，同时观察是否有典型的马铃薯卷叶病症状，记录并分析。

1.4 ELISA检测

在进行酶联免疫之前用普通PCR对这些转基因材料进行外源载体的潮霉素抗性基因检测（HYG基因），证明外源基因没有丢失。PCR所用上游引物为AAGTTCGACAGCGTCTCCGAC，下游引物为TCTACACAGCCATCGGTCCAG。PCR扩增参数：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s；60 ℃退火40 s；72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

ELISA检测步骤：①编号。将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照3孔、阳性对照3孔、空白对照3孔（空白对照孔不加样品，加提取缓冲液，其余各步操作相同）；②包被酶联板。每孔加配制好的包被抗体100 μL，封板膜封板后置于37 ℃温育4 min；③配液。将5倍Wash buffer加去离子水至1倍后备用；④洗涤。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复3次，拍干；⑤研磨。每样品取0.1 g叶片于匀浆管中，加入1 mL提取缓冲液，匀浆机7 500 r/min；⑥加样。分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照100 μL。然后在待测样品孔加待测样品100 μL，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；⑦温育。用封板膜封板后置37 ℃温育16 min；⑧洗涤。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复3次，拍干；⑨加酶标抗体。每孔加入酶标抗体100 μL；⑩温育。37 ℃温育1 h； 11 洗涤。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复4次，拍干；■配制底物液。将2 mL 5倍的底物缓冲液加去离子水至10 mL，再加2片PNPP底物药片（装底物液的瓶子用锡箔纸包裹）；13 显色。每孔先加入100 μL底物液，锡箔纸包裹酶联板于37 ℃避光放置1 h；14 终止。每孔加终止液50 μL 2 mol/mL硫酸，终止反应；15 测定。在加终止液后15 min内，用Bio-tek的Elx800酶标仪测定OD值。

2 结果与分析

2.1 大田植株表型变化

5p2-4叶片小而多皱褶，4p2-9矮化（图1），4p1-4、4p2-7植株高，5p2-6叶片皱缩，4p1-2矮化叶片小而稠密，4p1-1花期提前，4p2-6矮化，5p1-1较脱毒5号叶片颜色深，5p1-4叶片皱缩，稀疏，叶色浅（图2），5p1-5叶片小而皱褶（图3）。初步分析这些表型变化是由于在转入外缘基因时改变或破坏了原有的一些形状基因，如叶片形状、颜色、株高，从而导致表型改变，真正原因还需要进一步的功能学研究。

除了4号、5号外，转基因各株系没有出现典型的马铃薯卷叶病症状，如叶片卷曲、直立、干脆等。初步断定所转入的RNA干涉载体起到了沉默卷叶病毒基因的作用。

2.2 ELISA检测结果与分析

从图4可以看出，23个转基因株系通过PCR均扩增出潮霉素抗性基因，表明转基因材料在继代培养过程中外源基因没有丢失。图5为对参试材料进行ELISA试验的结果，颜色越深表明马铃薯卷叶病毒含量越高，植株的抗病性越差。反之表明植株中马铃薯卷叶病毒含量越低，抗性越强。

2012年11月24日进行ELISA试验，并用Bio-rad酶标仪进行测量。测量数据见表2、表3。

利用Excel函数工具和SAS软件对酶标仪测量数据进行分析得出，3个重复间相对标准偏差率小于15%，说明试验操作重复性较好，数据可用于分析。

其中4p1-3、4p2-3、4p2-7、4号、5p1-6、5p2-6、5号为阳性，初步说明除这几个株系以外的株系均有一定的马铃薯卷叶病毒抗性，所转入的RNA干涉载体起到了一定的干涉PLRV的作用。

以高原4号为受体的转基因株系与高原4号共15个株系，3个重复OD值及方差分析结果如表2所示。由表2可知，4p2-7与其他各号有极显著差异（P<0.01），4p2-4与其他各号有极显著差异，4p1-3、4号与其他各号有极其显著性差异。

以脱毒175为受体的转基因株系与脱毒175共14个株系，3个重复的OD值及方差分析结果如表3所示。由表3可知，5号与其他各参试材料均有极显著差异（P<0.01），5p1-6、5p2-6之间无显著差异，但与其他各号有极显著差异，5p1-6、5p2-6表现为阳性，可能是转入的干涉载体作用较弱。

3 小结与讨论

本试验利用大田试验发现了一些具有明显特征突变的转化体，初步推测转入基因破坏了马铃薯生长素基因或者是生长素转运蛋白基因，此现象可以作进一步的研究。

通过PCR扩增出了900 bp大小的潮霉素抗性基因条带，鉴定转基因馬铃薯中外源存在；利用酶联免疫法检测技术研究受侵染后马铃薯卷叶病毒基因在这些转化体中的表达情况，结果表明均有不同程度的抗性，从而验证RNA干涉技术策略的可行性，为得到对马铃薯卷叶病毒具有稳定抗性的马铃薯转基因植株提供依据。

参考文献：

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