携带重组腺病毒 BMP-2 的巨噬细胞对 C3H10 细胞成骨分化的影响

周少怀，杜谢琴，金 静，卞 峰，方红育

（武汉市第三医院，武汉 430060）

携带重组腺病毒 BMP-2 的巨噬细胞对 C3H10 细胞成骨分化的影响

周少怀，杜谢琴，金 静，卞 峰，方红育

（武汉市第三医院，武汉 430060）

目的：探讨携带BMP-2（Bone Morphogenetic protine-2）腺病毒的巨噬细胞对小鼠 C3H10 细胞的增殖和成骨分化的作用。方法：感染重组腺病毒 BMP-2的巨噬细胞与小鼠C3H10 细胞共培养。MTT 方法检测共培养体系中 C3H10 细胞的增殖能力；共培养 7 d 对C3H10细胞进行 ALP 染色和活性检测；细胞培养至 21 d，进行标茜素红染色检测矿化结节；定量PCR实验验证过表达腺病毒载体 BMP-2 有效性并且检测Runx2的表达；Western blot检测细胞中磷酸化 Smad1/5/8蛋白表达。结果：与对照组相比，巨细胞过表达BMP-2与 C3H10细胞共培养后，可以促进C3H10细胞增殖；ALP 染色程度和活性上升；矿化结节增多；定量 PCR结果显示 Ruxn2 RNA表达增加，Western blot 结果显示 Ruxn2 蛋白表达上升。结论：过表达 BMP-2 的巨噬细胞可以促进小鼠 C3H10 细胞的增殖，并且可能通过 BMPs 经典途径促进 C3H10 细胞的成骨分化。

成骨分化；巨噬细胞；BMP-2

骨折发生后，骨结构和血供破坏，单核细胞侵入受损组织分化为巨噬细胞［1］，巨噬细胞分泌像转化生长因子、肿瘤坏死因子、成纤维生长因子等因子，这些因子募集骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），促进其增殖、分化，并且合成胞外基质蛋白促进骨折愈合［2］。另外巨噬细胞可以通过影响钙化的血管细胞促进血管钙化［3］。越来越多的证据显示，巨噬细胞可以分泌骨形态发生蛋白-2（BMP-2）参与到体内的多重病理生理过程［4］。最近一些研究开始关注到骨折中巨噬细胞的多重作用［5］。研究发现巨噬细胞既可以调节破骨细胞活性，又能促进成骨分化。

BMP-2 是转化生长因子超家族成员之一［6］，是一种多功能生长因子，对胚胎骨形成及出生后骨生长有重要作用［7-9］。BMP-2 因为具有很强的成骨分化能力，所以已经被批准用于临床治疗骨折、骨质疏松等疾病引起的大面积骨缺损的修复［10］。BMP-2 主要通过激活Smads 信号传导和调节成骨基因转录而发挥作用［11］。

本实验旨在探讨在巨噬细胞中过表达 BMP-2 然后与 C3H10 细胞共培养，检测共培养体系中 C3H10 细胞的增殖和分化能力。

1 资料与方法

1.1 材料 小鼠 C3H10 细胞购于美国菌种保藏中心，小鼠巨噬细从 C57 小鼠腹腔分离。重组腺病毒Ad-RFP 和Ad-BMP-2 由本实验室构建保存。 DMEM高糖培养基和胎牛血清（Hylcone公司）；Transwell 小室（Millipore公司）。 PCR逆转录试剂、定量PCR试剂（TakaRa公司）；PCR引物和TRZIOL（Invitrogen公司）；碱性磷酸酶（ALP）活性检测试剂盒（Sigma 公司）；抗 Runx2（Runt related transcription factor 2）抗体（Abcam公司）及内参β-actin抗体（中杉金桥）；Western blot 发光试剂盒（北京英格恩公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠巨噬细胞分离及病毒感染 C57 小鼠脱臼处死后，腹部消毒。用注射器抽取5 mL含双抗的DMEM高糖培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，解剖小鼠，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中离心，并重复洗涤 3 次，铺板。在37 °C、5 % CO2的饱和湿度培养箱中培养 6 h，去除非粘附细胞。消化细胞后以 2×106/ mL密度接种细胞，待细胞贴壁后，加入合适浓度重组腺病毒，10 h 后，消化细胞，接种于 Tranwell 小室。

1.2.2 共培养体系的建立 小鼠 C3H10 细胞培养于含有100 U/ mL 青霉素、100 μg / mL链霉素和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。C3H10 细胞按2.0×105个/孔的密度接种于6 孔板，待细胞融合度达60% 时，将接种了巨噬细胞的 Transwell 小室置于 6 孔板上，开始共培养。24 孔板的共培养体系以此类推。

1.2.3 实验分组 实验组分为空白组（Blank）、对照组（Ad-RFP）、过表达BMP-2（Ad-BMP-2）组。 病毒感染效率在 50% 左右适宜。

1.2.4 MTT 检测细胞增殖能力 将共培养后 1-5 d 的 C3H10 细胞加入 500 µL MTT（5 mg/ mL），放入孵箱继续培养 4 h，小心吸弃孔内培养基，每孔加入 4 mL DMSO 溶液，避光震荡 10 min。将溶液转移到 96 孔板（200 µL/孔），于 490 nm 处检测吸光度 OD 值。

1.2.5 ALP 活性和染色测定 24孔板接种 30% 密度的 C3H10 细胞进行共培养。分别培养至第第 7 d，按照ALP 测定试剂盒说明书进行检测。

1.2.6 茜素红染色 按 1.2.5 所述接种细胞，进行共培养，下层培养基换为成骨诱导培养基（50 μM 维生素 C，10 mm β-磷酸甘油和100 nm地塞米松）。21 d 后取出细胞，吸弃培养基，PBS 洗涤 3 次，0.1 % 戊二醛固定10 min，ddH2O洗涤 3 次；吸弃去ddH2O，加入 0.4% 茜素红S，在显微镜下观察，待出现红色物质堆积时，弃去孔内染液，ddH2O 终止反应和洗涤，显微镜下拍照保存。

1.2.7 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验 各组细胞使用TRIZOL提取RNA，然后逆转录成cDNA。定量PCR 反应体系如下：cDNA 2 µL，上下游引物各0.4 µL，SYBR Premix Ex Taq 10 µL，ddH2O 6.4 µL，Total 20 µL。

1.2.8 Western blot 实验 共培养 5 d 后的 C3H10 细胞裂解后使用 10% SDS-PAGE 胶进行凝胶电泳。电泳完成后，将目标蛋白转膜至 PVDF 膜，5% 脱脂奶粉封闭 1 h，用1：1000 稀释 p-Smad1/2/8 和 β-actin抗体4℃ 封闭过夜。TBST 洗膜 3 次，每次 3 min，1：5000的二抗 37℃ 孵育 1 h。TBST 再次洗膜 3 次，发光显影。

1.2.9 统计学 统计学处理数据用均数±标准差表示，统计学数据均用SPSS16.0软件包处理，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 验证病毒有效性 巨噬细胞感染腺病毒 36 h 后，提取细胞总 RNA。qRT-PCR 结果显示，与 Ad-RFP 组相比，Ad-BMP-2 组 BMP-2 的 RNA 升高了约 10 倍左右（P＜0.01）（图 1）。说明过表达 BMP-2 腺病毒可以用于后续实验。

图 1 BMP-2 mRNA 在各组细胞间的表达。**P＜0.01。

2.2 过表达 BMP-2 的巨噬细胞促进 C3H10 细胞增殖

MTT 结果显示，C3H10 细胞与感染了过表达 BMP-2腺病毒的巨噬细胞共培养后，从第 3 d 起，C3H10 细胞增殖明显比对照组增快，一直持续到第 5 d 到达一个平台期（P＜0.05）（图 2）。

图 2 过表达 BMP-2 的巨噬细胞促进 C3H10 细胞增殖。*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 过表达BMP-2 的巨噬细胞促进 C3H10 细胞ALP 活性 C3H10 细胞与巨噬细胞共培养 7 d 后，利用 ALP 染色和活性检测 C3H10 细胞的一个成骨分化指标。结果显示，Ad-BMP-2 组的 ALP 活性比对照组明显升高（P＜0.01）（图 3 a）。化学染色结果也显示，Ad-BMP-2 组 ALP 染色加深（图 3 b）。说明过表达 BMP-2的巨噬细胞能够增强 C3H10 细胞的 ALP 活性。

图 3 过表达 BMP-2 的巨噬细胞促进 C3H10 细胞的 ALP 活性.**P＜0.01。

2.4 过表达 BMP-2 的巨噬细胞促进 C3H10 细胞矿化

C3H10 细胞共培养至 21 d 进行茜素红染色。结果表明，相比对照组，Ad-BMP-2 组矿化结节显著升高（图4）。说明在巨噬细胞中过表达 BMP-2 后与 C3H10 细胞共培养，可以促进 C3H10 细胞的钙盐沉积。

2.5 过表达 BMP-2 的巨噬细胞促进 C3H10 细胞成骨分化基因表达 共培养的 C3H10 细胞分别提取总 RNA和总蛋白。qRT-PCR 结果显示，Ad-BMP-2 组 Runx2 mRNA 表达明显上升（图 5 a）。Western blot 也显示 Ad-BMP-2 组 Runx2 蛋白表达升高（图 5 b）（P＜0.05）。

图 4 过表达 BMP-2 的巨噬细胞促进 C3H10 细胞的钙盐沉积

图5 过表达 BMP-2 的巨噬细胞促进 C3H10 细胞 Runx2 mRNA 和蛋白表达。*P＜0.05。

3 讨论

研究骨损伤和损伤后骨重建对于骨组织工程来说是非常重要的［12］。它可以帮助研究者设计更为合理的组织工程微环境；也可以帮助临床医生预测患者预后，制定更好的治疗策略。

骨损伤后，单核细胞被招募到受损组织分化为巨噬细胞，从而分泌多种因子，参与到骨重建过程当中［13］。BMP-2 就是这些因子中的一个［14］。而 BMP-2是当今研究最为透彻，也是成骨能力最强的 BMPs 家族成员。BMP-2 具有强大的成骨作用，所以它已经被开发用于临床治疗骨缺损骨不愈合［15］。但是具体机制却不是很清楚。

骨重建过程中离不开骨损伤周围的微环境［16］，所以本研究把微环境中重要的巨噬细胞、成骨细胞以及重要的成骨因子 BMP-2 一起纳入研究，使其更加接近体内真正的微环境。在巨噬细胞中过表达 BMP-2 后，与 C3H10 细胞共培养。实验结果显示，C3H10 细胞的增殖能力上升；成骨相关指标（ALP、矿化结节）都明显高于对照组。此外，作为转化生长因子家族中成骨分化中重要的转录因子 Runx2（Runt related transcription factor 2）基因水平和蛋白水平在巨噬细胞中的 BMP-2刺激下表达也明显升高。因此推测，共培养体系中C3H10 细胞增殖能力和成骨分化能力的提高可能是通过激活 Runx2，再启动相关基因活化导致，其具体机制还有待探讨。

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Macrophage carrying BMP-2 promote C3H10 cell osteogenic differentiation

Zhou Shao-huai，Du Xie-qin，Jin Jing，Bian Feng，Fang Hong-yu.
（Department of Orthopedics，Wuhan Third Hospital，Wuhan 430060，China）

Objective To investigate effects of macrophage carrying BMP-2 on C3H10 cell osteogenic differentiation. Methods macrophage cell which was infected recombinant adenovirus BMP-2 co-culture with C3H10 cells. MTT was used to detect the proliferation capacity of C3H10 cell. C3H10 cell was performed ALP histochemical stain and activity detection at 5 and 7 days. mineralized nodules were exa mined by alizarin red staining， after 21 days. Real-time quantitative PCR was used to confirm the recombinant adenovirus BMP-2 availability and analyze Runx2 expression level. p-smad1/5/8 was analyzed by Western blot. Results Compared with control group， overexpression of BMP-2 in macrophage cell in co-culture system， the proliferation of C3H10 cells was promoted， ALP activity was significantly stimulated，and matrix mineralization increased。Real-time quantitative PCR results showed that the mRNA level of Runx2 was increased， and Western blot results show that the Rxun2 was increased in BMP-2 overexpression group. Conclusion Proliferation and osteogenic differentiation of C3H10 cell was promoted in co-culture system of over-expressing BMP-2 in macrophage cell， and the mechanism is potential achieved via stimulating typical BMP signal pathway.

Osteogenic differentiation； Macrophage； BMP-2

R329.2

A

1673-016X（2016）02-0031-04

2015-08-20

武汉市卫生计生委医学科研项目（武卫（2011）98 NO WX11C16）

方红育，E-mail：389672635@qq.com