甜菊品种DUS测试指南的研制

王显生，王仲伟，李华勇，黄苏珍*，王艳萍，张继红，吴燕，沈奇*

甜菊品种DUS测试指南的研制

王显生1，王仲伟2，李华勇1，黄苏珍2*，王艳萍1，张继红1，吴燕1，沈奇1*

（1.江苏省农业科学院粮食作物研究所/农业部植物新品种测试（南京）分中心，南京210014；2.江苏省中国科学院植物研究所（南京中山植物园），南京210014）

植物新品种特异性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和稳定性（Stability）（简称为DUS）测试指南，是进行植物品种DUS测试的技术文件。通过连续两个生长周期的试验观测，编制了甜菊品种DUS测试指南。主要阐述了甜菊测试指南的研制原则、编制过程和主要内容。

甜菊；新品种保护；DUS测试；指南；研制

甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni.）又名甜叶菊、甜草，为菊科多年生草本植物，原产于南美洲巴拉圭、巴西。1975年的广交会上甜菊首次进入我国，但成功引种是1976年江苏省中国科学院植物研究所从日本引种成功[1-2]。现在我国北纬20～46°范围内都有种植。甜菊叶片中的甜菊糖具有高甜度和低热性，特别适用于食品工业和医药上。20世纪80年代初甜菊糖提取加工业逐渐兴起，经过30多年的发展，目前我国已是世界上最大的甜菊栽培和甜菊糖生产与出口国，并形成了相对成熟、稳定和完整的甜菊糖产业链，且已在国际竞争中占据着相对的优势。为了保护我国国内甜菊品种资源和知识产权，研制甜菊DUS测试指南成为当务之急。

我国于1999年4月24日加入国际植物新品种保护联盟（简称UPOV），成为第39个成员国，同年颁布实施《中华人民共和国植物新品种保护条例实施细则（农业部分）》，开始接受国内外植物新品种权申请。1997年颁布的《中华人民共和国植物新品种保护条例》规定，授权品种必须是在我国植物新品种保护目录范围内，且具有新颖性、特异性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和稳定性（Stability），并有适当命名的植物新品种。国家审查机构根据相关植物新品种DUS测试指南对该品种进行特异性、一致性和稳定性测试（简称DUS测试）[3]。DUS测试指南既是测试机构开展DUS测试工作的技术手册，同时还是审批机关审查新品种特异性、一致性和稳定性的技术标准。自我国开展植物新品种保护工作以来，截止2014年，已研制完成了适合我国使用的水稻、玉米和小麦等200多个农业植物新品种DUS测试指南。2014年本单位承担了农业部品种资源保护项目“甜菊新品种DUS测试指南的研制”，依据国家标准《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则》［4］，并遵循UPOV对DUS测试规定的总原则（TG/1/3）及配套规定的DUS测试指南编制的系列文件（TGP系列文件）［5-9］，开展该指南的研制工作。

1　研制原则和过程

1.1研制目标和原则

以《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则》（GB/T 19557.1-2004）[4]、《植物新品种特异性、一致性和稳定性审查和性状统一描述总则》[10]和《植物新品种测试指南的研制》（UPOV TGP/7/2）[7]等文件为指导，根据我国甜菊育种水平和生产现状，研制出符合我国国情和国际惯例的科学、准确、可操作性强的甜菊DUS测试指南，通过审定后作为我国开展甜菊品种DUS测试的技术标准。

指南研制过程中遵循以下7条原则：①以科学、准确、权威为编写指南的指导思想；②尽量收集鉴定技术较为成熟的甜菊性状，以使本指南有较好的适应能力；③用国际上通用的鉴定方法，与国际接轨；④以主要的植物形态特征为主，其他性状为辅。在主要植物形态特征不能区分新品种与近似品种时，方采用其他性状；⑤方法规范，条件统一，有较好的可操作性；⑥性状排列的顺序遵循植物学顺序；⑦标准品种的选择，尽量采用性状表达稳定，易获得的品种。

1.2研制过程

1.2.1收集整理种质资源上世纪80—90年代末期，我国从事甜菊育种研究的单位有江苏省中国科学院植物研究所、中国农科院、山东淄博市农科所、浙江亚热带作物所等单位，先后育出云日、云宾、186、187、中山1号等甜菊品种。其中，江苏省中国科学院植物研究所在种质资源收集、保存、育种、评价等方面是国内领先的单位，现已保存有甜菊种质资源100余份，品种资源15个，包括两个日本守田系列品种和国内其它一些栽培品种资源。自2013年起，我们在原有基础上收集甜叶菊品种资源，通过引种及市场购买等方式又搜集到20余份种质资源。经过比较、筛选，最终确定了有代表性的36份种质作为指南研制材料，进行田间试验。

1.2.2确定测试性状及其表达状态DUS测试指南的核心内容是测试性状及其表达状态。测试性状的观测结果是品种特异性、一致性和稳定性审查的主要依据。因此测试性状的选择极为重要。根据国家标准《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则》中的规定，DUS测试性状应满足以下6条基本要求：a）是特定的基因型或基因型组合的作用结果；b）在特定环境下，具有足够的一贯性和可重复性；c）为确定特异性，品种间表现出足够的差异；d）能够被准确定义和识别；e）满足一致性要求；f）满足稳定性要求，即反复繁殖或每个繁殖周期结束后，其结果具一贯性和可重复性。同时，对性状固有的商业价值或优势不做要求，但如果某些经济性状能达到上述规定的标准，也可以考虑作为DUS测试补充性状。

为全面、准确地选择甜菊DUS测试性状，查阅了国内外相关植物的DUS测试指南、品种描述等文献资料。在充分参考借鉴日本《甜菊DUS测试指南》的基础上[11]，结合我国甜菊育种、生产和科研等实际情况初步构建了要调查的包括42个性状的DUS测试性状表，并且通过对性状进行分级描述，确定了性状的测试方法和实验设计方案。

1.2.3田间测试和标准品种筛选根据试验设计方案，在2013年的田间预备试验中，采用目测和测量的方式采集参试品种的DUS测试性状数据，同时拍摄相关照片。经过分析整理后，删除了“植株：分枝习性”、“植株：生长势”和“花：大小”3个性状，保留了39个观测性状，并初步筛选出一批性状表达状态一致、稳定的品种作为候选标准品种留待第二年田间试验。

2014年继续开展田间种植试验，对上年筛选出的性状和候选标准品种继续田间测试性状数据采集，和照片拍摄。确定了甜菊DUS测试的种植方式和观测数量。对两年的数量性状测试数据进行分析，初步确定我国甜菊DUS测试中各数量性状的分级标准。

1.2.4测试指南的编制完善综合两年田间试验观测结果及实验室甜菊糖苷检测结果，编制了《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南甜菊》初稿。初稿包含24个基本性状和15个选测性状，共39个性状。初步确定了分组性状和技术问卷性状，确定了不同性状的最佳观测时期和方法，初步确定代表性状不同表达状态的标准品种。

2014年9月组织了专家咨询会。来自DUS测试、育种、栽培等领域的5位专家针对甜菊DUS测试指南初稿提出了32条修改意见。经讨论后决定采纳32条，最后形成甜菊DUS测试指南的函审稿，包含19个基本性状和16个选测性状，共35个性状。

2015年3月向中国农科院、上海市农科院、山东省农科院、安徽大学、南京农业大学、青岛农业大学、安徽科技学院等11家单位的12位专家发出了函审邀请。在收回的12份意见表中共有修改意见120条，我们经过慎重考虑后全部采纳了55条，部分采纳了1条。最后形成了甜叶菊DUS测试指南的送审稿，包含19个基本性状和16个选测性状，共35个性状。

2015年5月18日，甜菊DUS测试指南在北京通过了全国植物新品种测试标准化技术委员会组织的专家组审定，最终确立性状25个，标准品种6个。

2　甜菊DUS测试指南的主要内容

甜菊DUS测试指南包含以下几个主要部分：前言、范围、规范性引用文件、术语与定义、符号、繁殖材料的要求、测试方法、特异性、一致性和稳定性结果的判定、性状表、分组性状、技术问卷以及附录A（规范性附录）、附录B（资料性附录）和附录C（规范性附录）。其中特异性、一致性和稳定性结果的判定、性状表及其解释是测试指南的核心。

2.1适用范围

甜菊DUS测试指南适用于甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）品种特异性、一致性和稳定性测试和结果判定。

2.2繁殖材料的要求

繁殖材料的要求包括提供繁殖材料的形式、数量、质量和植物检疫方面的要求。虽然生产实践中甜菊主要以扦插苗进行繁殖，但考虑到部分育种家是以种子繁殖材料的情况，最终确定繁殖材料以扦插苗、种子形式提供。提交的扦插苗数量不少于300株，提交的种子不少于5 g。提交的扦插苗或种子应外观健康，活力高，无病虫侵害。苗的具体质量要求：高度8 cm～10 cm，5～6对叶，肉质根系3 cm～4 cm长的一年生茎尖苗。种子的具体质量要求：净度≧90%、发芽率≧50%、含水量≦15%。提交的扦插苗或种子应符合中国植物检疫的有关规定。

表1　甜菊品种DUS测试指南的测试性

2.3测试性状

由于UPOV并未制订甜菊DUS测试指南，所以在确定甜菊测试性状之初，主要参考借鉴了日本甜菊DUS测试指南等的性状描述方法和要求。并在此基础上，结合育种、生产和科研等实际情况，通过对甜菊形态学和生理学性状以及经济性状的稳定性和一致性进行充分地分析研究，最终选用了植株、茎、叶、花等性状25个（表1）。

2.3.1测试性状分析根据《植物新品种特性、一致性和稳定性审查及性状统一描述总则》（TG1/3）的性状选择要求，从最初观测的42个表型性状中，将不便观测、受环境影响较大、难以准确描述、相关性强的性状删除，最终保留25个性状，其中必测性状20个，选测性状5个。性状的排列顺序根据植物学顺序排列：植株、茎、叶、花。

甜菊测试性状按性状类别区分，质量性状（QL）有两个、假质量性状（PQ）有3个、数量性状（QN）20个。其中，质量性状是指植株表现不连续变状态的性状，如茎的花青甙显色有无；假质量性状是指其表达至少有部分是连续的，但其变化范围是多维的性状，如植株株型；数量性状是能以一维的、线性等级进行描述的性状，它显示性状从一个极端到另一个极端的连续变化。为了便于某一性状的描述，将描述范围分成几个表达状态，如植株高度：极矮（1）、矮（3）、中（5）、高（7）、极高（9）。

2.3.2分组性状为便于在甜菊DUS测试中科学、准确地选择近似品种，根据我国育种情况，参考日本测试指南，本指南确定了4个分组性状，植株：株型；茎：花青苷显色；叶：叶形；副花冠：内壁颜色。

2.4DUS测试判定标准

2.4.1特性判定申请品种应明显区别于所有已知品种。在测试中，当申请品种至少在一个性状上与近似品种具有明显且可重现的差时，即可判定申请品种具备特性。

2.4.2一致性判定对无性繁殖的品种，采用1%的群体标准和95%的接受概率。当样本大小为83～137株时，最多可以允许有3个型株。对种子繁殖的品种，采用10%的群体标准和95%的接受概率。当样本大小为103～110株时，最多可以允许有16个异型株。

2.4.3稳定性判定如果一个品种具备一致性，则可认为该品种具备稳定性。一般不对稳定性进行测试。必要时，可以种植该品种的下一批繁殖材料，与以前提供的繁殖材料相比，若性状表达无明显变化，则可判定该品种具备稳定性。

3　结语

甜菊DUS测试指南研制工作是根据国内外相关技术文件和中国植物新品种保护工作与国际接轨的需要，紧密结合我国甜菊科研实际，征求了各方面的意见和建议开展完成的。1999年至今，我国已经陆续公布了9批植物新品种保护目录，总计93个种属，涉及大田作物、果树、花卉和蔬菜等。随着我国《种子法》的修改，植物新品种保护力度得到加强，保护目录范围将逐步扩大。农业部目前向社会公开征求意见的“第十批农业植物品种保护目录”就包含了甜菊。因此，甜菊品种DUS测试指南的成功研制对保护甜菊育种者权利，开展甜菊新品种选育都将起到积极的促进作用。

[1]舒世珍，陈睦传，李钦，等.中国甜叶菊栽培及应用技术[M].北京：农业出版社，1994.

[2]何毓娟，李元彬.发展甜菊生产大有可为[J].中国糖料，1997（1）：52-56.

[3]农业部植物新品种保护办公室.中华人民共和国植物新品种保护条例实施细则（农业部分）[M].北京：中国农业出版社，1997.

[4]GB/T 19557.1-2004.植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则[S].

[5]TG/1/3.General introduction to the examination of distinctness，uniformity and stability and the development of harmonized descriptions of new varieties of plant[S].Geneva，Switzerland：UPOV，2002.

[6]TGP/14/1.Glossary of technical，botanical and statistical terms used in UPOV documents[S].Geneva，Switzerland：UPOV，2002.

[7]TGP/7/2.Developmentof the test guidelines[S].Geneva，Switzerland：UPOV，2010.

[8]TGP/9.Examining distinctness[S].Geneva，Switzerland：UPOV，2004.

[9]TGP/7/2.Examining uniform ity[S].Geneva，Switzerland：UPOV，2004.

[10]农业部植物新品种测试中心，全国植物新品种测试标准化技术委员会.植物新品种特异性、一致性和稳定性审查及性状统一描述总则（TG/1/3）[M].北京：中国农业出版社，2007.

[11]日本甜菊测试指南[S].http：//www.hinsyu.maff.go.jp/info/sinsakijun/botanical_taxon_e.htm l

Development of DUS Test Guideline for Stevia Variety

WANG Xian-sheng1,WANG Zhong-wei2,LIHua-yong1,HUANG Su-zhen2,WANG Yan-ping1, ZHANG Ji-hong1,WU-Yan1,SHEN Qi1
(1.Institute of Food Crops,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing Station for DUSTesting Center of New Plant Varieties, Ministry of Agriculture,Nanjing 210014;2.Institute of Botany,Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences(Nanjing Botanical Garden Mem.Sun Yat-Sen),Nanjing 210014)

The distinctness,uniformity and stability(DUS)test guideline of plant varieties was the technical standards for the DUS test.The test guideline of stevia(Stevia rebaudiana Bertoni)was developed based on the result of measurements and observations for two growing cycles of stevia.This paper gave detail description of compilation principle,the development process and themain content of stevia testguideline.

stevia;protection of new varieties;DUS test;guideline;development

S566.9

A

1007－2624（2016）03－0046－04

10.13570/j.cnki.scc.2016.03.015

2015-12-31

农业部品种资源保护项目（G488）；江苏省农业科技支撑项目（BE2014402）；江苏省农业自主创新项目CX（13）2020；江苏省中国科学院植物研究所青年基金项目（SQ201303）。

王显生（1977-），男，湖南永兴人，副研究员，从事植物新品种测试工作，E-mail：wangxiansheng80@126.com。

沈奇，女，研究员，从事植物新品种测试工作，E-mail:wangxiansheng80@126.com。

通信作者：黄苏珍，女，研究员，从事甜菊种质开发与创新研究，E-mail:hsz1959@163.com。