甘蔗根系内生真菌

廖楠，张金莲，汪茜，谭裕模，龙艳艳，李冬萍，陆祖军，陈廷速*

甘蔗根系内生真菌

廖楠1，3，张金莲1，汪茜1，谭裕模2，龙艳艳1，李冬萍1，陆祖军3，陈廷速1*

（1.广西农业科学院微生物研究所，南宁530007；2.广西农业科学院农业资源与环境研究所，南宁530007；3.广西师范大学生命科学学院，桂林541004）

在酸性赤红壤条件下，通过对大田甘蔗施用不同的化肥量和接种AM菌剂的试验，分析不同施肥水平对甘蔗根系内生真菌的影响。结果表明：甘蔗根系内同时存在两种内生真菌，即丛枝菌根（AM）真菌和深色有隔内生真菌（DSE）。通过对甘蔗根系进行染色观察后发现，凡是施复合肥的处理，在甘蔗根系中除了存在丛枝菌根（AM）真菌，还检测到较多的深色有隔内生真菌（DSE）的菌丝和微菌核。大田甘蔗施用AM菌剂影响土著AM真菌种群。

甘蔗根系；内生真菌；丛枝菌根真菌；深色有隔内生真菌

我国甘蔗种植区经过长期滥用化肥、农药和除草剂，土壤退化非常严重。许多蔗区土壤贫瘠，种植条件恶化[1]。蔗田土壤养分严重失衡，已无法通过增加施肥来提高产量，成为制约目前甘蔗产业持续发展的重要因素。丛枝菌根（arbuscularmycorrhizal，AM）是自然界中最普遍的一种菌根类型，它们能够促进宿主植物对土壤养分的吸收和利用，增强抗逆性，提高作物产量。甘蔗根际土壤AM真菌资源丰富[2]，AM真菌被誉为“生物化肥”，它不仅能提高土壤pH值，而且增加甘蔗的株高和有效茎数，提高甘蔗产量[3]。深色有隔内生真菌（dark septate endophytes，DSE）也是一类定殖于植物根内的小型土壤真菌，生态学功能与AM真菌类似，在植物的生长过程中发挥着重要作用。因此，研究甘蔗根系内生真菌，利用它们来改善甘蔗土壤生态，提高甘蔗抗逆性和化肥利用率具有重要的应用价值。

1　材料与方法

1.1试验材料

供试甘蔗品种:新台糖22号。所用的丛枝菌根真菌菌株为Rhizophagus aggregatus（原聚丛球囊霉），为本课题组分离自甘蔗根际土壤。采用河沙为主要培养基质，以玉米为宿主植物，接种R.aggregatus，生长期间每周喷淋浓度为25%～50%的Hoagland营养液，培养4个月后，将孢子、宿主根系和培养基质一起作为接种物（AM菌剂）。

1.2试验设计

2013—2014连续两年分别在广西隆安县的国家甘蔗产业技术体系甘蔗试验基地实施。共设6个处理：A.AM；B.AM+50%复合肥（375 kg/hm2，下同）；C.AM+复合肥（750 kg/hm2，下同）；D.空白对照；E.50%复合肥；F.复合肥。施用AM菌剂（3个处理）与不施AM菌剂（3个处理）之间，设立隔离区30m。每个处理3个小区，采用拉丁方设计。每个小区面积7m×5.5m。其中行距1.1m，共5行。每行7m，下种量50个双芽苗，共100个芽。复合肥比例为N∶P∶K=15∶5∶15（拉多美复混肥料，广东拉多美化肥有限公司）。

1.3检测

1.3.1内生真菌侵染检测将甘蔗根样置于20%的KOH溶液中90℃水浴透明90 min～120 min；用清水冲洗3～5次后，加入碱性H2O2（10%H2O210mL，氨水1 mL，蒸馏水189 mL）脱色60 min；用5%的乙酸酸化5 min后，用5%的墨水醋染液（Quink牌纯黑墨水）为染液，66℃染色30 min，用清水（至少12 h以上）脱色后即可镜检。

1.3.2甘蔗根际土壤AM真菌孢子的检测孢子的分离采用湿筛倾注-蔗糖离心法，称取20g土样放入搅拌机内并加入600mL水，快速搅拌旋转3～5s，使土块或根系中的孢子充分散落，静置1～2s后通过3层不同孔径（从上往下孔径依次为：0.8mm，0.25mm，0.055mm）的土壤标准筛即可筛取出孢子，转置表面皿上，用体视显微镜观察孢子形态，测定孢子密度。每个处理重复3次。

2　结果与分析

2.1甘蔗根系内生真菌

不同处理的甘蔗根系侵染结果如图1。在甘蔗根系中，除了丛枝菌根真菌，还存在深色有隔真菌（DSE）。DSE的主要特点是菌丝为有隔菌丝，存在微菌核结构。在6个不同的处理中，处理B和C的小区AM真菌的菌丝和泡囊结构较为丰富。此外，在施用复合肥的小区（B，C，E，F）中，DSE的微菌核结构出现频率较高。AM真菌和DSE可同时存在同一甘蔗根系中，它们之间是否存在相关性（是协同还是拮抗）？有待进一步研究。

图1　不同施肥水平甘蔗根系内生真菌（AM真菌及DSE真菌）Fig.1 The endophytic(AMF and DSE)in roo ts of sugarcane w ith diffe rent treatm ents

2.2甘蔗根际土壤AM真菌种群结构

对不同处理的甘蔗根际土壤进行AM真菌种群分析。所进行试验的地块存在5种不同类型的AM真菌（包括接种的AM菌株）：R.Aggregatus、Acaulospora.sp.1、蜜色无梗囊霉（A.mellea）、地表球囊霉（G. versiforme）和G.sp.5。A、B、C均施用了AM菌剂，土壤中检测不到G.sp.5，但存在A.sp.1和G.versiforme。此外，在施复合肥的处理中，不管是否施用AM菌剂，都没有检测到A.mellea。说明大田甘蔗施用AM菌剂和化肥，影响了甘蔗根际土壤AM种群结构。不同菌株的形态特征如下：

2.2.1A.sp.1的形态特征孢子果未知，孢子椒红至棕红色，近球形或椭圆形，50.57～109.00×66.28～147 μm，表面常有无色或浅黄色覆盖物。孢子壁一层，层状，外层颜色深，内层棕黄色，壁上常有不规则浅沟和近圆形坑洞，坑洞纵向贯串孢子壁，而浅沟仅在外表面。

2.2.2蜜色无梗囊霉（A.mellea）的形态特征孢子：土壤中单生，侧生于产孢子囊菌丝上，浅棕黄色至棕黄色，球形或近球形，有时椭圆形，直径105～130×142～162μm。孢子壁3层（L1、L2和L3）：L1，易逝壁，无色，厚＜0.5μm，紧贴于L2，在Melzer’s试剂中呈浅黄色；L2，层状壁，浅黄色至棕黄色，厚3.0～4.8μm，L1消解后表面光滑；L3，膜状，无色，厚小于1μm。芽壁两层（GW1，GW2）：GW 1，膜状，无色，两层（GWl-L1和GWl-L2），厚约1μm，孢子破裂后易皱。GW 2，两层（GW 2-L1和GW 2-L2），GW 2-L1，厚约1μm，表面有珠状纹饰，在Melzer’s试剂中呈浅黄色，GW2-L2，具可塑性，在Melzer’s中染成绛紫色。脱落痕，圆形至椭圆形，直径8～11μm。

2.2.3聚丛球囊霉（R.Aggregatus）的形态特征孢子：浅灰色、浅黄色至浅棕色，在土壤中丛生或单生，球形或近球形，（30～45）～70μm，或椭圆至不规则形（30～72）×（42～100）μm。孢子壁：一层或两层，（1.5）～（2.5～3）μm；如果两层，外层较厚，浅黄色，层状壁；内壁比外壁薄，亮黄色，轻压则内外壁可分。连孢菌丝在连点处宽2.5～9μm，连点开放或由细隔封闭，直立或在接近连点处突然弯曲。内含物油滴状，白色或淡银灰色。

2.2.4地表球囊霉（G.versiforme）的形态特征孢子：土壤中单生，孢子果未知，孢子球形或近球形，黄至黄棕色，显微镜下沿孢壁有一圈深色，大小82～136μm。孢壁3层，L1无色透明易逝壁，约1μm，成熟时常脱落或只剩部分残屑；L2浅黄至黄棕色层状壁，厚2～4μm，厚度较均匀；L3单一壁，约1μm，不易与L2分离，亮金黄色。连孢菌丝：无色透明，宽4.3～6.8μm，成熟孢子中常萎缩或脱落。连点宽7.6～12.0μm，直或小喇叭形，开放或由一内壁形成的隔封闭。内含物油滴状。

2.2.5G.sp.5的形态特征孢子果未知，孢子深棕红色，近球形，直径约110μm。孢子壁一层，层状，厚7.8～8.0μm，至连点处增厚至9.45μm，壁上有纵向裂纹，外层颜色较深，暗棕红色；内层棕黄色，表面饰有高4.42～6.09μm、基部直径2.54～4.37μm乳状突起。连点开放，宽19.10μm。

3　讨论

AM真菌是自然界分布最为广泛的一种植物根系内生菌根真菌，能与绝大多数植物根系形成稳定的共生结构。深色有隔内生真菌（DSE）也是一类定殖于植物根系的小型真菌，其一般特征是菌丝颜色较深、具明显横隔，广泛存在于健康植物根的表皮、皮层甚至维管束组织的细胞内或细胞间隙，能够在植物细胞内或细胞间隙形成“微菌核（microsclerotia）”。普遍存在于重金属污染、寒冷或干旱等极端环境中[4]。本研究还发现，施复合肥处理的甘蔗根系能被DSE高度侵染，并能形成有隔菌丝、微菌核。这可能与所种植的地块土壤理化性质相关。所种植的地块为强酸性赤红壤，其pH仅为4.02。种植后期，仅施有AM菌剂的处理A的pH为5.03，而空白对照（D）的pH为4.49。施有AM菌剂且施复合肥的B和C，其pH分别为4.43和4.33，而仅仅施复合肥的E和F，其pH分别为4.06和4.22。在甘蔗根系的内生真菌检测中，在施用复合肥的小区（B、C、E，F）中，DSE的微菌核结构出现频率较高，也许与土壤pH过低相关。

关于DSE与AM真菌的相关性。有的研究认为AM定殖结构和DSE存在负相关[5]，也有研究认为DSE有隔菌丝和总定殖率与AM定殖率存在显著正相关，DSE和AM真菌之间可能存在协同共栖关系，两者相互协调平衡，相辅相成，共同促进根系吸收土壤矿物元素和水分[6]。有的研究认为DSE的分泌物对AM菌丝的生长具有一定的调节辅助作用[7]。在本研究中，虽然在施用复合肥的处理（B、C、E、F）中，DSE的微菌核结构出现频率较高，但E和F的微菌核结构要多于施用AM菌剂的处理B和C。施用AM菌剂的处理（A、B、C），其根系内AM泡囊、菌丝和菌丝圈多于对照（D、E、F）。但具体如何影响，有待进一步探讨。

甘蔗是旱地连作作物，利用根系内生真菌来改善退化的土壤生态，减少化肥用量都具有很好的应用前景。近年来，我们所开展的AM菌剂在大田甘蔗的应用试验结果表明，在施用AM菌剂后，能促进甘蔗植株生长，增加有效茎数，提高甘蔗产量。在一些试验地块，即使复合肥减少50%，产量并没有受到影响[3，8-9]。我们国家农业土壤退化严重，国家农业部提出了下一个五年计划的化肥零增长，提高化肥利用率40%以上的目标。利用作物根系内生真菌是很好的选择。它们不仅能促进植物生长，提高抗逆性，还能降低化肥的施用量，减少化肥对生态环境的污染，促进我国生态农业的可持续发展。

[1]黄绍富，黄杰基.蔗区土壤肥力现状与甘蔗测土配方施肥[J].广西蔗糖，2006（4）：10-13.

[2]陈廷速，张金莲，李松，等.广西东南沿海蔗区根际土壤AM真菌多样性研究[J].南方农业学报，2012（1）：57-61.

[3]陈廷速，李松，王维赞，等.甘蔗大田接种AM菌剂效应研究[J].甘蔗糖业，2013（3）：6-10.

[4]Derama A,Languereau-Lemanb F,Howsamc M,et al.Seasonal petterns of cadmium accumulation in Arrhenatherum elatius (poaceae):influence ofmycorrhizal and endophytic fungal colonization[J].Soil Biology&Biochemistry,2008,40(3):845-848.

[5]吴艳清，贺学礼，刘泗泗.荒漠环境柠条锦鸡儿AM真菌空间分布[J].河北农业大学学报，2008，31（4）：36-40.

[6]张娟，贺学礼，王晓乾，等.干旱环境下羊柴DSE与AM真菌和土壤因子关系研究[J].河北农业大学学报，2015，38（1）：72-77.

[7]Scervino JM,Gottlieb A,Silvani V A,et al.Exudates of dark septate endophytic modulate the development of the arbuscular mycorrhizal fungus Gigaspora rosea[J].Soil Biology&Biochemistry,2009,41:1753-1756.

[8]伍荣冬，谭彩丽，李廷化，等.大田接种丛枝菌根真菌对甘蔗品种“福农41号”生长的影响[J].甘蔗糖业，2015（4）：20-23.

[9]卢李威，卢文祥，汪茜，等.AM菌剂对甘蔗品种“柳城07-500”的大田生长效应分析[J].中国糖料，2016，38（2）：5-7.

The Endophytic Fungus in Sugarcane Root

LIAO Nan1,3,ZHANG Jin-lian1,WANG Qian1,TAN Yu-mo2,LONG Yan-yan1, LIDong-ping1,LU Zu-jun3,CHEN Ting-su1*
(1.Micobiology Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China;2.Resourses and Environment Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China;3.College of Life Science,GuangxiNormal University,Guilin 541004,China)

To investigate the influence of fertilizer on endophytic fungus of sugarcane root in acid red soil, sugarcane plants were grown on different level of fertilizer and inoculated with arbuscular mycorrhizal fungus (AMF).The results showed that there are two kinds of endophytic fungus in sugarcane root,the arbuscular mycorrhizal(AM)fungus and dark septate endophytes(DSE).Through the dyeing observation of the root sugarcane,more septate hypha and microsclerotia of DSE were found besides AM fungus in the soil applied complex fertilizer than the others.The communities of soil AMF were affected by AMF inoculants.

sugarcane root;endophytic fungus;arbuscularmycorrhizal fungus;dark septate endophytes

S435.661

A

1007－2624（2016）03－0006－04

10.13570/j.cnki.scc.2016.03.002

2015-10-10

国家自然科学基金项目（31360356）；国家甘蔗产业技术体系（CARS-20-3-5）；广西农业科学院科技项目（2014YP06，2015YT81，2015YZ10）。

廖楠（1991-），女，硕士研究生，研究方向：土壤AM真菌多样性。E-mail：454749513@qq.com。

陈廷速（1966-），男，博士，研究员，研究方向：甘蔗根系内生真菌资源。E-mail：chen20409@hotmail.com。