高效液相色谱法测定药品中的二硫苏糖醇和氧化型二硫苏糖醇

罗 宁， 刘平怀*， 吴晓娜， 陈 晨， 张 玲， 何沂飞， 李 昂

(热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验实，海南大学材料与化工学院，海南海口 570228)

二硫苏糖醇(DTT)属于常用的巯基试剂，其挥发性低、难闻气味较少，而且氧化电位低。DTT的氧化态(DTTox)为环状结构，其结构稳定，所以具有较高的还原性。在DNA提取实验中常常添加DTT打断蛋白质之间的二硫键，使DNA充分游离，提高DNA的提取效率[1,2]。DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键，因此，在蛋白质提取中添加DTT可以保护蛋白质结构不被破坏[3,4]。

试验药品有效成分为工程菌的代谢产物，是一种活性蛋白。在生产过程中添加DTT用来保护目标蛋白结构，维持药物活性。DTT属于巯基化合物，还原性较强，在体内可能会破坏蛋白质结构，从而引起酶失活等现象，目前常用凝胶过滤[5]和透析[6]去除DTT。DTTox会使肌酸激酶结构发生变化，达到一定浓度时甚至会使肌酸激酶完全失活[7]。因此必需对该药品中的DTT和DTTox进行检测。目前有报道用二硫苏糖醇分光光度计测定钴离子含量[8]，但DTT极容易被氧化，且滴定法灵敏度不高，所以不能采用钴离子来反滴定DTT。DTTox也没有有效检测方法。高效液相色谱法在药品检测中应用较广[9,10]。因此，本文采用高效液相色谱法同时对药品中DTT和DTTox进行检测，确保药品的安全性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

大连依利特高效液相色谱仪，包括DAD230+二极管阵列检测器，P230高压恒流泵，EC2000工作站，柱温箱，在线脱气机；BT224S/BT25S电子天平(赛多利斯公司)；超声清洗器(深圳洁盟)；pH计(上海雷磁)。

DTT对照品(Amresco，2934C515，Purity(-SH Content)：99.5%，Loss on Drying：0.4%，美国)；DTTox对照品(SIGMA-ALDRICH，D3511，Purity(TLC)≥99%，美国)。甲醇为色谱纯(美国TEDIA)；三氟乙酸为分析纯；水为娃哈哈(纯净水)。

试验药品由本实验室生产，四批药品批号为：S20140507、S20140509、S20140607和S20140609。

1.2 实验方法

1.2.1色谱条件色谱柱：Waters X-Bridge C18(250×4.6 mm,5 μm)；流动相:体积比30∶70的甲醇-水(含0.02%三氟乙酸)；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：210 nm；进样量：100 μL。

1.2.2溶液的制备分别称取DTT和DTTox对照品1.26 mg ，置于25 mL容量瓶中，纯净水稀释至刻度，配制成50 μg/mL的单对照品储备溶液。各取DTT和DTTox对照品溶液0.5 mL，置于10 mL容量瓶中，纯净水稀释到刻度，配制成2.5 μg/mL的混合对照品溶液，摇匀，过滤。

精密称取药品100.00 mg，置于10 mL容量瓶中，用纯净水稀释至刻度，摇匀，过滤，配制成10 mg/mL的样品溶液。以过滤后的纯净水为空白溶液。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

从DAD光谱图可以看出DTTox在波长283 nm处有吸收峰，但在200 nm附近也有较强吸收且高于283 nm处的吸收峰值，DTT在210 nm附近有较强吸收,这与之前报道的巯基化合物最大吸收基本一致[11,12]。为了提高方法的灵敏度，选择波长210 nm作为DTT和DTTox的检测波长。在此检测波长下吸收较大，同时峰的纯度较高，能较好满足分析检测要求。

2.2 色谱分离条件的优化

流动相首先采用了水与甲醇，采用等度洗脱，调整比例发现当比例为70∶30时DTT的峰形较好，但DTTox的峰不对称，有拖尾现象。在流动相中添加0.02%三氟乙酸及采用40 ℃柱温后得到较对称的DTTox峰。在选定流动相下DTT在5 min左右出峰，DTTox在7 min左右出峰，且都能达到较好的分离。精密吸取空白溶液、混合对照品溶液、药品溶液及药品与混合对照品的混合液各100 μL，分别注入色谱仪，记录色谱图，结果表明，主峰的理论塔板数N均大于20 000，拖尾因子在1.0左右，药品中其他成分不干扰DTT和DTTox的检测，分离度良好，能够满足DTT和DTTox定量检测的要求。结果见图1。

图1 系统适用性考察色谱图Fig.1 Chromatograms of system suitability investigation A.Blank;B.Rererence substance;C.Sample;D.Sample+Reference substance.1.DTT；2.DTTox.

2.3 专属性试验

将空白溶剂和药品经高温、强光、强酸、强碱、氧化和水浴等条件破坏，依次进样。结果表明，药品经高温、强光、强酸、强碱、氧化、水浴条件破坏后有一定的降解，且降解产物与主峰能够较好分离，说明药品中降解产物对DTT和DTTox的检测没有干扰，方法的专属性较好。

2.4 定量限和检出限

分别取DTT和DTTox对照品溶液，用纯净水逐级稀释，进样并记录色谱图。以信噪比(S/N)=3及10来确定DTT和DTTox检出限与定量限[13]。结果表明，DTT和DTTox的检出限均为0.02 μg/mL，定量限均为0.07 μg/mL。

2.5 线性关系

精密移取DTT和DTTox标准储备各0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 mL，分别置于100 mL容量瓶中，用纯净水稀释至刻度配制成不同质量浓度的混合对照溶液，依次进样，以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。DTT在0.22～8.68 μg/mL范围内线性良好，线性方程为：Y=54501X-2731.8(r=0.9999)；DTTox在0.23～9.20 μg/mL范围内线性良好，其线性方程为：Y=70939X-3578.4(r=0.9998)。

2.6 溶液的稳定性

取同一份混合对照品溶液，分别在室温和5 ℃冰箱冷藏下放置 0、2、4、6、8 h 后进样测定，比较峰面积的变化情况。结果表明，室温下DTT和DTTox 2 h内峰面积相对标准偏差(RSD)大于15%，说明混合对照溶液在室温下不稳定；而5 ℃冰箱冷藏下DTT和DTTox 4 h内峰面积RSD分别为2.26%、1.17%，说明混合对照溶液在5 ℃冷藏下4 h是稳定的。

2.7 精密度和回收率

精密移取同一混合对照品溶液100 μL，连续进样6次，结果DTT峰面积RSD为0.51%，DTTox峰面积RSD为0.78%，表明方法精密度良好。

精密称量100 mg药品，置于10 mL量瓶中(称取6份，分成3组)。每组分别精密称取适量DTT和DTTox对照品，配置高、中、低3个浓度的混合对照溶液进行加标回收率试验，结果见表1。DTT和DTTox的平均回收率分别为99.32%和99.49%，RSD(n=6)分别为2.34%和2.23%，能满足药品中DTT和DTTox含量的检测。

表1 DTT和DTTox加标回收率(n=6)

2.8 样品测定

在选定色谱条件下检测4批药品，取每批次药品平行测定两次。结果均未在药品中检测出DTT和DTTox。试验所选药品浓度为10 mg/mL，检出限均为0.02 μg/mL，说明药品中DTT和DTTox的含量均小于2 mg/kg。

3 小结

本文建立了一种高效液相色谱测定药品中DTT和DTTox含量的方法，并通过方法学考察验证该方法的可靠性。该方法具有操作简便、分离度好、灵敏度高、重复性好、回收率高等优点，为DTT和DTTox提供了一种有效检测方法。