原位离子液体-分散液液微萃取/高效液相色谱法测定水中的氯霉素

周惠燕， 陈 珏, 王嘉俊

(1.浙江医药高等专科学校生物与制药学院，浙江宁波 315100； 2.浙江大学宁波理工学院，浙江宁波 315100)

氯霉素(Chforamphenicol，CAP)属于广谱抗生素，由于其低廉的成本和良好的治疗效果，被广泛用于养殖业以预防动物疾病和促进动物生长，不仅使食品中残留了氯霉素，过量的氯霉素还会进入环境，如水和土壤中形成持续性的污染，严重危害人类的健康。因此,研究一种快速、简便、高灵敏度的分析氯霉素残留的方法具有重要意义。

目前已经报道的用于氯霉素残留分析检测的样品前处理方法有溶剂萃取[1]、加速溶剂萃取[2]、固相萃取[3]、基质固相分散技术[4]、分散液液微萃取[5]等。分散液液微萃取(DLLME)是一种简单、快速并且廉价的前处理方法，但是使用有机溶剂作为萃取剂和分散剂。离子液体分散液液微萃取(IL-DLLME)以离子液体替代传统的有机溶剂作为萃取剂，而分散剂依然是有机溶剂。原位离子液体-分散液液微萃取技术(insituIL-DLLME)以亲水性离子液体作为萃取剂，离子交换剂作为分散剂被引入通过原位复分解反应形成具有疏水性的离子浑浊溶液。该方法非常快速，并且未使用有机溶剂，目前已成功的用于测定一些水样中的污染物[6 - 8]。本实验在原位IL-DLLME法萃取水中氯霉素的研究中引入涡旋辅助萃取，并结合高效液相色谱(HPLC)法测定氯霉素的含量，对影响实验的各种参数进行了研究，建立了简便、快速、环保的分析水样中氯霉素的方法。本实验为进一步研究涡旋辅助原位IL-DLLME法萃取其它基质(如食品)及环境中的氯霉素奠定基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-2010AHT高效液相色谱仪(日本，岛津公司)；XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)；台式低速离心机(上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂)；WBFY-201微电脑微波化学反应器(巩义市予华仪器有限责任公司)。

氯霉素标准溶液：准确称取氯霉素标准品(贵州迪大生物科技有限责任公司，批号GZDD-1021)置于100 mL容量瓶中，加少量甲醇溶解后，加水配制成质量浓度为104 μg·mL-1的氯霉素标准品储备溶液。甲醇(色谱纯)；甲醇(分析纯，中国杭州化学试剂有限公司)；亲水性离子液体1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([C2MIN][BF4])、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([C4MIN][BF4])、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([C6MIN][BF4])、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([C8MIN][BF4])，均购自宁波市鄞州铭浩医药化工有限公司；双三氟甲磺酰亚氨基锂(LiNTF2)、六氟磷酸钾(KPF6)购自上海成捷化学有限公司)。实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

在15 mL的微波管中加入5 mL水样，加入40 μL亲水性离子液体[C6MIN][BF4]，涡旋震荡混合1 min，使亲水性离子液体与水样充分混合，然后加入500 μL离子交换剂LiNTF2，旋涡震荡混合5 min，80 W微波辐射1 min，冷却至室温，然后将微波管置于转速10 000 r·min-1的离心机中离心8 min，移去上层水相，抽取下层疏水性离子液体相测定总体积V总，后以HPLC法测定氯霉素的峰面积A。最后计算校正峰面积=[V总(μL)/定量环20(μL)]×A。校正峰面积的大小即代表氯霉素的提取效率。

1.3 高效液相色谱条件

色谱柱:Hypersil ODS柱(250×4.6 mm，5 μm )；流动相：水-甲醇(40∶60,V/V)；流速:1.0 mL·min-1；进样环体积:20 μL；柱温:25 ℃；检测波长:275 nm。

2 结果与讨论

2.1 亲水性离子液体种类的选择

离子液体的性质在萃取中起着重要作用。本研究中的离子液体必须是亲水性的，当加入离子交换剂后变为疏水性的离子液体，1-烷基-3-甲基咪唑基四氟硼酸盐系列符合该特点。在水中添加氯霉素(加标质量浓度为104 μg·mL-1)用于实验条件优化。取加标水样5 mL置于15 mL的微波管中，分别用4种亲水性离子液体[C2MIN][BF4]、[C4MIN][BF4]、[C6MIN][BF4]、[C8MIN][BF4]作为萃取剂，以LiNTF2作为离子交换剂，萃取剂与离子交换剂的体积分别为70 μL和500 μL。其余步骤同1.2，最后比较4种不同亲水性离子液体萃取条件下氯霉素的校正峰面积。结果显示[C6MIN][BF4]的提取效率最好。

2.2 亲水性离子液体体积的优化

亲水性离子液体的体积对于目标物的萃取效率有很大影响。本文分别以20、30、40、50、60、70、80、90 μL的[C6MIN][BF4]为萃取剂，以500 μL LiNTF2作为离子交换剂，其余步骤同1.2。结果表明，当[C6MIN][BF4]体积从20 μL增加至40 μL时，氯霉素的提取效率逐渐增加，此后氯霉素的萃取效率随着[C6MIN][BF4]体积的增加而降低。因此选择40 μL [C6MIN][BF4]为最佳实验条件。

2.3 离子交换剂种类的选择

LiNTF2和KPF6是两种非常好的离子交换剂，加入包裹了药物的亲水性离子液体后，通过离子交换作用，使亲水性离子液体变为疏水性离子液体，达到分离的作用。实验过程中，当使用KPF6溶液时，发现KPF6在常温下水中的溶解度较低，而且在使用离子交换剂后，离心分离后在管子底部形成固体状的离子液体分层，无法进行HPLC分析。因此选择LiNTF2作为离子交换剂。

2.4 离子交换剂体积的选择

离子交换剂LiNTF2在原位IL-DLLME萃取过程中起到重要的作用，LiNTF2过少会导致置换反应发生不完全，萃取效率低；LiNTF2过多会改变溶液中的盐浓度，对萃取效率造成影响。本文分别以300、400、500、600、700、800 μL的离子交换剂LiNTF2考察其对氯霉素萃取效率的影响。结果表明，当LiNTF2体积从300增至500 μL时，萃取效率增加，此后萃取效率大幅度下降。因此选择加入LiNTF2的体积为500 μL。

2.5 微波辐射时间的选择

微波辐射能够给样品提供能量，影响化合物的相互作用和反应速率，从而可能影响水中氯霉素的提取效率。本文在80 W下改变辐射时间，分别设置0、30、50、60、70、90 s，其余步骤同1.2，最后计算不同微波辐射时间下氯霉素的提取效率。结果氯霉素的提取效率在未经微波辐射时最大，而微波辐射后提取效率显著下降，可能的原因是微波辐射的功率太大产生热量不利于离子液体之间进行离子交换。

2.6 涡旋震荡的选择

涡旋震荡是将混合物充分混合均匀，增加化合物间的接触机会，可能会影响水中氯霉素的提取效率。实验设置了两次涡旋震荡，第一次涡旋震荡是在加入亲水性离子液体后，目的是使亲水性离子液体与加标水样增大接触面积，充分混合均匀，帮助亲水性离子液体更好的萃取水中氯霉素；第二次涡旋震荡是在加入离子交换剂后，目的是使离子交换剂与包裹着氯霉素的的亲水性离子液体充分混合均匀，促进离子交换。结果如表1。研究结果表明第一次涡旋震荡反而使氯霉素的提取率降低，第2次涡旋震荡可提高氯霉素的提取效率。

表1 不同涡旋震荡条件对氯霉素提取效率的影响

2.7 线性范围

用已配制好的104 μg·mL-1的氯霉素标准品储备溶液稀释配制氯霉素浓度为5.2、10.4、20.8、52、78、104 μg·mL-1，进行HPLC分析。以浓度(c)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标作图，得到标准工作曲线方程为：A=34.427c+6.1076,相关系数r=0.9999。氯霉素在5.2～104 μg·mL-1内线性关系良好。

2.8 回收率与检测限

原位置换IL-DLLME法萃取水中氯霉素最佳实验条件为:5 mL水样，加入40 μL亲水性离子液体[C6MIN][BF4]轻轻手动摇晃混匀，然后加入500 μL离子交换剂LiNTF2，旋涡震荡混合5 min，然后将微波管置于转速10 000 r·min-1的离心机中离心8 min，移去上层水相，抽取下层疏水性离子液体相测定体积并以HPLC法测定其中氯霉素的含量。向空白水样中添加3个浓度水平的氯霉素标准溶液，按最佳实验条件进行原位置换IL-DLLME法萃取水中氯霉素及上述HPLC测定条件进行回收率实验，每个添加水平做6个平行，结果见表2。氯霉素的平均回收率为82.7%～89.4%，相对标准偏差(RSD)为3.5%～5.3%。本方法检测限为5.2 μg·L-1。

表2 样品中氯霉素的回收率和相对标准偏差(n=6)

2.9 实际样品分析

应用本方法对来自浙江地区多个水库、养鱼塘、城市自来水、河水、海水等30份水样进行检测，均未检测到水样中氯霉素残留。

3 结论

本文将一种新型的样品预处理技术即涡旋辅助原位IL-DLLME法用于水样中氯霉素的萃取富集，通过优化样品预处理以及结合HPLC测定方法，建立了简便、快速、环保的测定水中氯霉素残留的分析方法。