枸杞润肤霜中两种酚酸类成分的高效液相色谱检测及质谱确证

刘少静， 刘 萌， 郭秀英， 韩 禄， 杨黎彬*

(西安医学院药学院，陕西西安 710021)

枸杞是茄科植物枸杞的干燥成熟果实，是我国传统名贵中药材之一，具有调节机体免疫功能、抗肿瘤、抗衰老、调节血脂、降血糖、促进造血功能等药理方面的作用[1,2]。近年来，中药化妆品已成为化妆品新产品开发的热点之一。有报道显示，枸杞提取液可显著提高小鼠皮肤中超氧化物歧化酶(SOD)的活性，增加皮肤中胶原蛋白含量，减少脂质过氧化产物丙二醛的含量，具有延缓皮肤衰老的作用[3]。另有文献报道枸杞中酚酸类化合物具有很好的生物活性，如阿魏酸有抗血栓、清除自由基、抗菌消炎等作用；咖啡酸和绿原酸可抗菌抗病毒、抗肿瘤、抗氧化清除自由基等[4,5]。

目前，对枸杞中酚酸类物质及其它成分的检测已有较多报道[6 - 8]，但枸杞在化妆品领域的应用及化妆品中酚酸类物质的检测技术报道则不多见。本研究建立了同时测定自制枸杞润肤霜中绿原酸和咖啡酸2种酚酸类物质的高效液相色谱(HPLC)分析及质谱(MS)确证方法，该方法能够为化妆品中酚酸的监测提供科学依据，同时为枸杞在化妆品领域的应用开辟广阔的前景。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Aglient 1260型高效液相色谱仪(美国，安捷伦科技有限公司)；Agilent 1260/6460液相色谱-质谱联用仪(美国,安捷伦科技有限公司)；FA1004B电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UV-160A紫外检测仪(日本，岛津公司)；L-550台式低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

绿原酸、咖啡酸对照品(纯度≥98%，中国药品生物制品检定所提供)；枸杞(黑果枸杞，产地：青海，由西安医学院药学院冯永辉副教授鉴定)；枸杞润肤霜(实验室自制)；甲醇(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2 液相色谱条件

色谱柱：Aglient HC-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.5%乙酸水溶液(27∶73，V/V)；流速：1.0 mL/min；检测波长：327 nm；柱温：30 ℃，进样量：10 μL。

图1 标准品和样品的色谱图Fig.1 Chromatograms of standards and the sampleA.standard;B.the sample of wolfberry cream;C.blank matrix.1.chlorgenic acid;2.caffeic acid.

1.3 液相色谱-质谱确证条件

液相色谱条件：色谱柱：UItisiLTMXB-C18(250×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.5%乙酸水溶液(27∶73，V/V)；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

质谱条件：ESI电离源；负离子扫描模式；干燥气(N2)体积流量为12 L/min；干燥气温度为250 ℃；雾化器压力为70.00 psi；质量扫描范围：m/z80～1 000；碰撞能量：17 eV。绿原酸母离子、子离子(m/z)分别为353.3、191；咖啡酸母离子、子离子(m/z)分别为179、135。

1.4 标准溶液的配制

分别精密称取绿原酸，咖啡酸对照品适量，加甲醇溶解并定容，制得2个对照品浓度分别为500 μg/mL、450 μg/mL的对照品储备液。用甲醇将2个对照品储备液按不同倍数稀释，制得系列混合对照品溶液。其中绿原酸浓度依次为：250、125、50、25、10、5、3.3 μg/mL，咖啡酸浓度依次为：225、112.5、45、22.5、9、4.5、3 μg/mL，4 ℃冷藏备用。

1.5 枸杞润肤霜样品前处理

精密称取自制枸杞润肤霜1.0019 g置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声震荡提取20 min，提取液转移至离心管中，以4 000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，滤液待测。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

本实验采用甲醇-HAc为流动相，实验考察了不同浓度的酸对目标成分分离效果的影响，分别采用甲醇-0.5%HAc、甲醇-0.1%HAc、甲醇-1%HAc对样品进行等度洗脱，结果表明在甲醇-0.5%HAc的条件下主峰与其它杂质峰分离度及峰形均良好，可实现准确定量分析枸杞及枸杞润肤霜中酚酸类有效成分的目的。为避免样品中杂质的干扰，经反复试验，最终确定甲醇-0.5%HAc水溶液的最佳比例为27∶73。

2.2 检测波长的选择

对一定浓度的绿原酸和咖啡酸标准溶液进行全波长扫描。结果表明：绿原酸、咖啡酸均在280 nm、327 nm波长处有吸收，但在327 nm处有最大吸收，故选择327 nm为检测波长。

2.3 柱温的选择

柱温对目标化合物的色谱保留及分离选择性有一定的影响。本研究考察了柱温25～40 ℃下的分离情况。结果表明，当柱温为30 ℃时，目标化合物的色谱峰之间实现了良好的分离。

优化色谱条件下的色谱图见图1。

2.4 定量标准曲线的绘制

精密吸取系列混合对照品溶液各10 μL，按照“1.2”节色谱条件进样分析，以各酚酸的进样浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程。结果见表1。

表1 2种成分的回归方程、相关系数与线性范围

2.5 精密度试验

选取一个浓度下的混合对照品溶液，按照“1.2”节色谱条件，连续进样5次，测得绿原酸、咖啡酸峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为1.18%、1.36%，表明精密度良好。

2.6 回收率试验

精密称取同一批已知含量的自制枸杞润肤霜5份，各约0.5 g，置于10 mL容量瓶中。分别加入绿原酸、咖啡酸对照品溶液适量，制成供试品溶液，按照“1.2”节进样分析。测得绿原酸、咖啡酸加标回收率见表2。由表2可见：绿原酸、咖啡酸平均加标回收率分别为98.28%、99.26%；RSD均为1.93%。

表2 绿原酸及咖啡酸加样回收率实验结果(n=5)

2.7 样品测定

称取枸杞润肤霜适量，按照“1.5”节方法制备样品溶液，平行处理3份样品，应用本方法进行测定，计算绿原酸和咖啡酸的含量，结果见表3。自制的枸杞润肤霜中绿原酸、咖啡酸含量分别为0.0398 mg/g、0.0323 mg/g。

表3 枸杞润肤霜中两种酚酸类成分的含量测定结果

3 结论

目前在化妆品领域尚未有枸杞中酚酸类成分含量的测定方法，对用于中药化妆品的枸杞的检测存在空白。本研究建立了同时测定自制枸杞润肤霜中2种酚酸类物质的高效液相色谱分析及质谱确证方法，该方法具有操作简便、回收率高、精密度良好等特点，为化妆品中酚酸的监测工作和质量控制提供科学依据，同时为枸杞在化妆品领域的应用开辟了广阔的前景。