诺氟沙星对斑马鱼胚胎发育的毒性作用及对TGF-β1的影响

王冬梅谷从友刘铜张琼宇李培胡晓军

（1.皖北卫生职业学院人体解剖学及组织胚胎学教研室，宿州 234000；2.蚌埠医学院病理学教研室，蚌埠 233030；3.蚌埠医学院组织学与胚胎学教研室，蚌埠 233030；4.永州职业技术学院基础医学部，永州 425100）

诺氟沙星对斑马鱼胚胎发育的毒性作用及对TGF-β1的影响

王冬梅1谷从友2刘铜3张琼宇4李培4胡晓军4

（1.皖北卫生职业学院人体解剖学及组织胚胎学教研室，宿州 234000；2.蚌埠医学院病理学教研室，蚌埠 233030；3.蚌埠医学院组织学与胚胎学教研室，蚌埠 233030；4.永州职业技术学院基础医学部，永州 425100）

旨在通过观察不同浓度诺氟沙星对斑马鱼胚胎不同发育时期的毒性作用，以及对TGF-β1基因表达的影响。配制诺氟沙星浓度为0、10、20、40 μmol/L，将斑马鱼胚胎暴露在上述浓度的诺氟沙星中。观察在胚胎不同发育时期，诺氟沙星对斑马鱼脊柱弯曲、心包囊肿、卵黄囊肿和死亡率的影响，以及使用实时定量聚合酶链式反应（qPCR）检测其对TGF-β1基因表达的影响。结果显示，诺氟沙星对斑马鱼的胚胎发育有明显影响，主要表现在脊柱弯曲、心包囊肿和卵黄囊肿，随着诺氟沙星暴露浓度的增大，胚胎的发育延迟，孵化时间延长，胚胎死亡率增加；当诺氟沙星暴露浓度为40 μmol/L时，96 hpf的胚胎死亡率达到76.45%；与正常状态相比，暴露于不同浓度诺氟沙星的斑马鱼胚胎中TGF-β1基因的mRNA表达随发育时间延长而增加趋势减缓。说明诺氟沙星对斑马鱼胚胎发育的致畸作用与致死作用有显著的影响。提示水体中残留的诺氟沙星对鱼类的生殖与发育具有潜在的危害。

诺氟沙星；斑马鱼；胚胎；致畸；致死；TGF-β1

长期以来，抗生素被大量地用于人和动物疾病的治疗及各类动物养殖业中。由于抗生素具有不能被人和动物机体完全代谢的特性，大多以原形和活性代谢产物的形式通过病人和畜禽的粪、尿液直接排入环境，现有研究表明，在世界各国的各类水体中均检测出多种类、不同浓度的抗生素。中国抗生素滥用现象尤为严重，已成为威胁人们健康和生存的隐患，抗生素污染已成为不可忽视的环境问题［1］。诺氟沙星（Norfloxacin）是第三代喹诺酮类的抗生素药物，对多种革兰氏阴性杆菌和部分革兰氏阳性球菌具有杀菌作用。通过直接作用于细菌的核酸，干扰细菌DNA合成，破坏核酸的拓扑结构，从而影响细菌的代谢与增殖。由于诺氟沙星的抗菌谱广，抗菌效用强，疗效良好，因此在国内广泛应用于水产养殖中细菌性疾病的预防。随着喹诺酮类药物的使用日益广泛，其不良反应及毒副反应也逐渐显现。有学者认为喹诺酮类药物均存在潜在的心脏毒性，而有些喹诺酮类药物还具有软骨毒性、消化系统不良反应及肝肾功能损伤等作用［2］。生物处于胚胎时期暴露在污染环境中对其发育具有严重的危害，尤其对脊椎动物的危害作用尤甚，因其胚胎早期对污染物具有非常敏感的毒理效应，而鱼胚胎比成鱼对环境的污染源更加敏感［3］。

斑马鱼（Dario rerio，zebrafish）属于硬骨鱼类辐鳍纲鲤形目鲤科鲐属，是国际经济协作和发展组织（Organization for economic co-operation and development，OECD）确定的模式生物，其基因组测序已基本完成，与人类基因组的同源性高达87%［4］。斑马鱼生活周期短，产卵量高且胚胎透明、体外发育易于观察。此外，斑马鱼胚胎发育阶段通常对毒性作用敏感，已被广泛应用于评估化学污染物的毒性成为生态毒理学研究的一种重要方法［5］。Yoder等［6］研究发现斑马鱼具有与人类白蛋白表面受体基因簇同源序列。因此，在斑马鱼中进行药物实验的结果对人类具有重要的参考价值。转化生长因子β（Tranforming growth factor-β，TGF-β）是由多种结构相关的多肽生长因子组成，具有免疫调节，细胞的生长分化，原始细胞迁移以及组织损伤修复等作用［7］。TGF-β信号途径对动物的生长发育具有多方面的调控作用，在脊椎动物的胚胎发育中参与胚胎内胚层和中胚层的形成。诺氟沙星的对胚胎致畸作用通过对TGF-β1基因表达的差异显示出来。本实验采用斑马鱼作为实验动物，观察不同浓度诺氟沙星暴露浓度对斑马鱼胚胎的不同发育时期的致畸作用和致死作用，以及对TGF-β1基因表达的影响，为确认水体中诺氟沙星在对胚胎致畸作用及其分子机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 诺氟沙星购自浙江华义医药有限公司，纯度大于98%，用0.1%盐酸溶液溶解制备为1mmol/L的储备液；Holtfreter培养液配制：每升水里添加0.025 g碳酸氢钠，0.05 g氯化钾，3.5 g氯化钠，0.l g氯化钙，溶解后调pH至7.2；Hank’s培养液配制参考文献［6］；其他试剂为国内分析纯。

1.1.2 动物 本实验鱼种属于AB品系斑马鱼。斑马鱼养殖于循环水养殖系统，水温26-28℃，pH值为6.8-7.5，电导率为880±20 μs/cm，饲养用水经过系统曝气过滤，光照昼夜比为14 h/10 h，以新孵化的丰年虫喂食，每日早晚一次。在交配前一天，挑选成年个体较大，游动形态正常的健康斑马鱼，以雌雄数目1∶2的比例置于预先加入新鲜Holtfreter液的孵化器，孵化器内加入能让鱼卵通过的纱网。成鱼受光刺激后开始产卵，收集胚胎后经过消毒清洗，初步挑选后将胚胎置于10%Hank’s培养液中，置于培养箱中培养。待胚胎生长至6 hpf时，弃去未受精的鱼卵，剩下的受精胚胎进行下一步实验。

1.2 方法

1.2.1 诺氟沙星的斑马鱼胚胎暴露 参考OECD标准，取6孔板，每孔放置10颗6 hpf的受精卵，加入5 mL Hank’s培养液。通过胚胎预实验确定暴露的浓度范围。用曝气自来水稀释诺氟沙星储备液为0、10、20和40 μmol/L，助溶溶液体积控制为0.1%，每个浓度设3个平行。将6孔板置于培养箱中，在光照昼夜比为14 h/10 h的光周期下进行培养，用显微镜观察胚胎形态，直至96 hpf的胚胎发育情况。每天更换50%培养液，并保持药物浓度稳定。观察指标：胚胎死亡、脊柱弯曲、心包囊肿和卵黄囊肿，并进行记录。以毒理学终点的出现作为观察胚胎发育的毒性，见表1。

表1 斑马鱼胚胎各阶段的毒理学终点

1.2.2 qPCR检测TGF-β1基因在斑马鱼胚胎发育中的表达 收集经各浓度诺氟沙星处理的处于24、48、72和96 hpf斑马鱼正常胚胎各20颗，按照Trizol说明书进行操作，提取总RNA。用逆转录酶合成cDNA，以cDNA为模板进行qPCR反应。以β-actin作为参照。反应条件为：94℃ 30 s；57℃ 30 s；74℃ 1 min；共35个循环。TGF-β1引物：上游5'-CGTCTTCCAGCAAGCTCAGA-3'，下游5'-TCCGAAGACGCAATTCTGCT-3'；β-actin引物：上游5'-GATGCGGAAACTGGCAAAGG-3'，下游5'-GAGGGCAAAGTGGTAAACGC-3'。反应结束后，标准曲线和扩增曲线有PCR仪器自动生成，将TGF-β1与内参基因进行比较，得出目的基因相对表达量的变化，所得结果直接在荧光定量操作软件中进行分析比较。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS16.0软件对数据进行统计分析，方差分析采用单因素方差分析，实验数据以±s表示，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 诺氟沙星对斑马鱼胚胎的致畸作用

如图1所示，随着诺氟沙星浓度的增大，胚胎的发育延迟，孵化时间延长，胚胎细胞色素沉淀。斑马鱼胚胎在低浓度暴露下48 hpf时已出现脊柱弯曲现象，随着暴露浓度增加，脊柱弯曲现象增加；在20 μmol/L浓度暴露下96 hpf时出现卵黄囊肿，而40 μmol/L浓度暴露下48 hpf已出现卵黄囊肿；40μmol/L浓度暴露下96 hpf时出现心包囊肿。观察96 hpf时不同诺氟沙星浓度暴露下对脊柱弯曲的影响（图2-A），随着诺氟沙星浓度增加，脊柱弯曲增加趋势明显；斑马鱼胚胎卵黄囊肿的出现率如图2-B。在不同诺氟沙星浓度暴露下，斑马鱼胚胎的发育均不正常。其脊柱弯曲与卵黄囊肿的发生率与诺氟沙星的浓度是正相关的量效关系。

图1 不同浓度诺氟沙星暴露下对斑马鱼胚胎的影响

图2 诺氟沙星对斑马鱼胚胎96 hpf时脊柱弯曲（A）和卵黄囊肿（B）的影响

2.2 诺氟沙星对斑马鱼胚胎的致死作用

实验进行至96 hpf时，诺氟沙星各暴露浓度下的斑马鱼胚胎均有一定的死亡（图3）。随着诺氟沙星浓度的增加，胚胎的死亡率逐渐增高。在诺氟沙星暴露浓度为40 μmol/L时，96 hpf的胚胎死亡率达52.16%，表明诺氟沙星的浓度与斑马鱼胚胎的死亡率具有正相关的量效关系。

图3 诺氟沙星对斑马鱼胚胎96 hpf死亡率的影响

2.3 诺氟沙星对TGF-β1基因在斑马鱼胚胎发育中的表达

采用qPCR方法检测在不同诺氟沙星暴露浓度下，斑马鱼胚胎中TGF-β1基因的表达情况。TGF-β1标准曲线相关系数为0.996，说明定量结果准确可靠，标准曲线良好（图4）。系统以前8个循环的荧光信号作为阀值，根据荧光信号的变化规律自动生成扩增曲线（图5）。如表2所示，未加入诺氟沙星的斑马鱼胚胎中可检测到TGF-β1基因，随胚胎发育而其表达加强；在经过诺氟沙星暴露后，TGF-β1基因的表达与未加入诺氟沙星的胚胎相比有所下降，但随胚胎发育其表达仍呈上升趋势。

图4 TGF-β1定量标准曲线的建立

图5 TGF-β1在斑马鱼胚胎不同发育阶段（0 μmol/L诺氟沙星）的扩增曲线图

3 讨论

生物对环境因素的改变非常灵敏，当环境改变后生物的相应生理活动状态的改变可作为评估化合物毒性和环境风险评估的重要指标之一。斑马鱼作为国际标准化组织（ISO）河水毒性试验的推荐鱼种，斑马鱼成为仅次于小鼠的第二优先脊椎模式动物［8］。国内外许多学者进行了酒精等物质对斑马鱼神经影响的实验，并进行毒性评价。Fenske等［9］研究发现内分泌干扰物（Endocrine disrupting chemicals，EDCs）会干扰斑马鱼的雌激素受体而影响内分泌系统和生殖系统。

表2 诺氟沙星对TGF-β1基因在斑马鱼胚胎不同发育阶段的表达

鱼类的TGF-β亚家族具有TGF-β2、TGF-β2、TGF-β3和TGF-β6四种异构体，其中TGF-β1是表达最广泛的亚型。斑马鱼成鱼的TGF-β1大量分布在胸腺、头肾和外周血淋巴细胞中，主要参与生殖和免疫调控。本实验通过qPCR检测发现，TGF-β1在正常斑马鱼胚胎中有表达。随着正常胚胎发育，TGF-β1基因的表达逐渐升高，与文献报道一致［10］，斑马鱼早期胚胎TGF-β1基因的mRNA表达水平随胚胎生长发育而逐渐增加。暴露在不同浓度的诺氟沙星中，斑马鱼胚胎在不同发育时期的TGF-β1基因的mRNA表达显著低于未加入诺氟沙星的胚胎。而TGF-β1基因的低表达对于卵黄的血管形成和造血功能有显著影响，产生卵黄缺血后，极易造成胚胎的死亡［11］。提示TGF-β1基因的表达异常，可能对斑马鱼胚胎具有致畸作用或致死作用；诺氟沙星能够抑制斑马鱼胚胎中TGF-β1基因的表达，从而影响胚胎的发育。

本实验结果表明，一定浓度诺氟沙星对斑马鱼胚胎具有致畸作用及致死作用；诺氟沙星对TGF-β1参与斑马鱼胚胎发育调控具有抑制作用。随着药物附着在养殖用水中排放至土壤或进入水体中，抗生素逐渐成为水资源的安全使用的巨大威胁，由于抗生素与其他农药和有机物不同，尽管在水体中浓度较低，但对环境与人类的危害巨大，可以通过作物吸收积累而进入人类和动物的食物链，继而在食物链中富集，对人体健康造成巨大的危害。因此，我们应引起水体中抗生素污染的重视。

4 结论

本研究直接通过诺氟沙星的斑马鱼胚胎暴露实验发现，诺氟沙星对斑马鱼的胚胎发育有明显的致畸和致死作用；通过qPCR检测TGF-β1基因在斑马鱼胚胎发育中的表达实验发现，诺氟沙星降低对生长发育具有调控作用的TGF-β1基因表达。

［1］Faria M， López MA， Fernández-Sanjuan M， et al. Comparative toxicity of single and combined mixtures of selected pollutants among larval stages of the native freshwater mussels（Unio elongatulus） and the invasive zebra mussel（Dreissena polymorpha）［J］. Science of the Total Environment， 2010， 408（12）：2452-2458.

［2］梁惜梅. 诺氟沙星和三氯生对剑尾鱼的毒性效应［D］. 广州：暨南大学， 2010.

［3］Bechmann RK， Larsen BK， Taban IC， et al. Chronic exposure of adults and embryos of Pandalus borealis to oil causes PAH accumulation， initiation of biomarker responses and an increase in larval mortality［J］. Marine Pollution Bulletin， 2010， 60（11）：2087-2098.

［4］Tsang M. Zebrafish：a tool for chemical screens［J］. Birth Defects Res C Embryo Today， 2010， 90（3）：185-192.

［5］毛晶琳. 萘普生的斑马鱼胚胎发育毒性及其臭氧降解特性研究［D］. 杭州：浙江工业大学， 2013.

［6］Yoder JA， Mueller MG， Wei S. et al. Immune-type receptor genes in zebrafish share genetic and functional properties with genes encoded by the mammalian leukocyte receptor cluster［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2001， 98（12）：6771-6776.

［7］ Wu MY， Hill CS. TGF-β Superfamily signaling in embryonic development and homeostasis［J］. Developmental Cell， 2009， 16（3）：329-343.

［8］Lammer E， Carr GJ， Wendler K， et al. Is the fish embryo toxicity test（FET）with the zebrafish（Danio rerio）a potential alternative for the fish acute toxicity test？［J］. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol， 2009， 149（2）：196-209.

［9］Fenske M， Segner H. Aromatase modulation alters gonadal differentiation in developing zebrafish（Danio rerio）［J］. Aquatic Toxicology， 2004， 67（2）：105-126.

［10］佟静媛， 柳星峰， 贾顺姬. Rbb4l 促进TGF-β/Nodal信号转导和斑马鱼胚胎的背部发育［J］. 遗传， 2013， 35（4）：477-487.

［11］候少丰， 李艳丽， 徐功玉， 等. 斑马鱼胚胎发育过程中TGF-β1基因的表达特征分析［J］. 水生生物学报， 2014， 38（6）：1054-1061.

（责任编辑李楠）

The Deleterious Effects of Norfloxacin on Zebrafish Embryonic Development and TGF-β1 Expression

WANG Dong-mei1GU Cong-you2LIU Tong3ZHANG Qiong-yu4LI Pei4HU Xiao-jun4
（1. Department of Human Anatomy and Histoembryology，North Anhui Health Vocational College，Shuzhou 234000；2. Department of Pathology，Bengbu Medical College，Bengbu 233030；3. Department of Histology and Embryology；Bengbu Medical College，Bengbu 233030；4. Faculty of Basic Medicine，Yongzhou Vocational Technical College；Yongzhou 425100）

The aim of this work is to investigate the deleterious effects of norfloxacin on zebrafish embryonic development in different periods， and determine its effects on TGF-β1 expression. Zebrafish embryos were exposed to different concentrations of norfloxacin（0， 10，20， and 40 μmol/L）. The effects of norfloxacin on spinal curvature， pericardial cyst， yolk edema and mortality of zebrafishes in the different developmental periods were observed. Furthermore， the mRNA level of TGF-β1 was examined by qPCR. The results showed that norfloxacin had significantly deleterious effects on zebrafish embryonic development， as mainly evidenced by spinal curvature， pericardial cyst and yolk edema. With the increase of concentration of norfloxacin， embryonic development was delayed， and the hatch period and mortality increased. The mortality rate of zebrafish embryos at 96 hpf re ached 76.46% after exposure to 40 μmol/L norfloxacin. Moreover， comparing with control group，the increase trend on mRNA level of TGF-β1 in zebrafish embryo exposing to different dose of norfloxacin slowed down with the prolonging of development time. Conclusively， norfloxacin has teratogenic and lethal effects on zebrafish embryonic development， suggesting norfloxacin residue in water system has serious latent dangers to the reproduction and development of fish.

norfloxacin；zebrafish；embryos；teratogenesis；lethal；TGF-β1

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.028

2015-08-09

湖南省教育厅科学研究项目（13C970）

王冬梅，女，副教授，研究方向：人体解剖学及组织胚胎学教学与科研；E-mail：506346640@qq.com

张琼宇，男，博士，讲师，研究方向：发育生物学；E-mail：drwuzurong@126.com