植物天冬氨酸蛋白酶的研究进展

葛伟娜 李超 张家琦 张岚 王振怡

（华北理工大学生命科学学院，唐山 063009）

植物天冬氨酸蛋白酶的研究进展

葛伟娜 李超 张家琦 张岚 王振怡

（华北理工大学生命科学学院，唐山 063009）

天冬氨酸蛋白酶是四大类蛋白水解酶之一，广泛存在于多种生物中，参与了很多重要的生理过程。相对于其他生物而言，对植物天冬氨酸蛋白酶的研究相对滞后。自20世纪末以来，这一领域的工作取得了重大进展。经典的植物天冬氨酸蛋白酶除了具有保守的蛋白酶结构域外还有一段植物特有的插入片段；在动植物分离之后，植物天冬氨酸蛋白酶基因家族进行了大规模的扩增；该类蛋白酶在植物的整个生长发育过程中发挥重要的功能，尤其是胁迫反应、有性生殖、衰老和程序性死亡以及蛋白质的加工和降解。对近些年植物天冬氨酸蛋白酶的研究进展进行综述，并对其未来的发展进行展望。

天冬氨酸蛋白酶；加工和灭活机制；胁迫反应；有性生殖；程序性死亡

天冬氨酸蛋白酶（Aspartic proteinases，APs；EC3.4.23）是一类以天冬氨酸残基作为催化活性位点的蛋白水解酶，该类蛋白酶在新合成时都是以单链的酶原形式存在，经过加工形成具有催化活性的蛋白酶单体或异源二聚体［1］。APs广泛存在于各种生物中，包括脊椎动物、植物、酵母、线虫、绿藻及病毒等，很多重要的蛋白酶都属于此类蛋白酶，如胃蛋白酶（Pepsin）、肾素（Renin）、组织蛋白酶D（Cathepsin D）、逆转录病毒蛋白酶（HIV-1 proteinase）等。在MEROPS（http：//merops.sanger. ac.uk/）数据库中，根据APs氨基酸序列的同源性、进化关系以及蛋白质的三级结构，将该类蛋白酶分成了6个类群，16个家族，其中，植物APs主要分布在AA类群中的A1和A11家族，少数在AC和AD类群中［2］，并且在多物种、多组织中都鉴定到了植物APs［3-6］。与动物APs类似，植物APs也是在酸性pH中有活性，大部分能被胃蛋白酶抑制剂特异性抑制。相对于动物来说，人们对植物APs的研究相对滞后一些，然而，自20世纪末，越来越多的植物APs被人们所鉴定和认识，人们发现植物APs也有一些自己特异的结构和功能。本文将对近些年APs的研究结果做一全面总结和归纳，旨为全面认识该领域及推进其进一步发展提供一定的现索。

1 植物天冬氨酸蛋白酶的一般结构

对目前所鉴定到的植物APs的氨基酸序列进行分析发现，其前体结构具有一些共同特征，如图1所示，典型的植物APs前体一般都具有以下结构域：N端的信号肽、前片段（Prosegment）、N端结构域、植物特有的插入片段（Plant specific insert，PSI）、C端结构域以及两个催化基序Asp-Thr-Gly（DTG）和Asp-Ser-Gly（DSG）［7］。除了典型的植物APs外，近些年还鉴定到一些植物APs没有PSI结构域，但具有典型APs所包含的其他结构域，如大麦珠心细胞中的nucellin［8］，烟草叶绿体中的CND41［9］，拟南芥和水稻中的CDR-1［10，11］等，根据其结构和序列的相似性，进一步被分为两大类，一类为nucellinlike的APs；另一类被称为非典型的APs［7］。

图1 植物天冬氨酸蛋白酶的一般结构

目前只有两个APs的三级结构被解析：Cardosin A的成熟形式［12］和phytepsin的前体［13］，两个蛋白酶都属于典型的APs，成熟形式都是双链蛋白酶，其三级结构与A1家族中的非植物成员有类似的折叠方式，包括β折叠，多个α螺旋，两个肽段组成两个球形结构，催化活性位点位于两个球形结构的中间，连接活性位点与球形结构的两段肽段比较灵活，允许合适的底物进入到催化裂口与活性位点相接触，从而决定着APs的底物特异性［1，14］。

2 植物APs特有的结构——PSI

典型的植物APs前体几乎都有一个约100个氨基酸组成的蛋白序列，称为植物特有的插入片段PSI。该片段位于植物APs前体的C端，在蛋白酶成熟的过程中PSI被裂解去除形成二聚体，也有部分APs保留了PSI形成单体APs［15］。在动物和微生物的APs中没有PSI序列的同源片段，但是该序列与鞘脂激活蛋白样蛋白（Saposin-like protein，SAPLIP）高度相似。重组的StAsp-PSI的三维结构被解析了，发现PSI含有6个保守的半胱氨酸残基，三维结构显示有5个兼性的α-螺旋，这些螺旋通过3个二硫键连接在一起形成一个致密的球形结构。此外，还有一些疏水残基和一些糖基化位点［15］。但是随后的研究发现，PSI并不是一个真正的saposin-like 结构域，而是saposin-like 结构域的N端和C端交叉后形成的新结构，因此又称作swaposin 结构域［13，16］。计算机模拟分析显示，植物PSI已经形成了一种新的不同于SAPLIP 家族的三级结构［17］。

PSI有哪些功能呢？人们根据其结构特点推测可能具有与SAPLIP家族相似的功能，如指引蛋白定位于囊泡，裂解细胞膜，参与防御反应等。事实上，近些年的实验也证明了PSI确实具有上述功能。在烟草原生质体的瞬时表达实验中，将phytepsin中的PSI删除后，导致变短的phytepsin分泌到胞外，而野生型的phytepsin一直在囊泡中累积，因此推测PSI与APs的前体从高尔基体到囊泡的分选有关［18］。土豆StAsp中的PSI能够以剂量依赖的方式杀死两种病原菌，这是由于PSI能与病原菌的细胞壁或细胞膜直接接触，导致细胞膜的渗透性增强最终使得细胞裂解病原菌死亡［19］。而最新结果显示StAsp-PSI导致细胞膜不稳定的主要原因是与细胞膜结合的时间而非浓度［20］，这之间的矛盾还需要更多的实验来证明。另外，番茄中的lycoAP-PSI和食虫草中的NaAP4-PSI也通过破坏细胞膜的方式参与了植物的病原菌防御反应和细胞死亡时的自溶过程［21，22］。目前PSI的酵母表达体系已经建立，这对于更深入的研究PSI抗菌性具有非常重要的意义［23］。

PSI的不同功能是由什么决定的呢？对StAsp-PSI的序列分析显示它与番茄中的lycoAP-PSI和食虫草中的NaAP4-PSI一致性最高［19］，而与蛋白分选类的PSI序列的一致性较低，如prophytepsin中的PSI［13］，这些结果暗示着PSI的功能与氨基酸的组成有关系。Terauchi等［24］为了验证PSI的功能，在拟南芥悬浮细胞的原声质体中瞬时表达了去除PSI的soyAP1和soyAP2的GFP融合蛋白，结果soyAP1的亚细胞定位与野生型并无区别，仍然定位于囊泡中，而soyAP2则发生了变化，突变后的soyAP2有时定位于内质网偶尔运输到囊泡中，分析soyAP1和soyAP2的序列发现二者的一致性只有40%，再次证明了PSI的功能与氨基酸的序列有关。

3 植物天冬氨酸蛋白酶的加工和灭活机制

绝大多数植物APs必须经过一系列的加工才能从无活性的酶原形式变成有活性的蛋白酶。APs前体的加工主要包括信号肽、前片段和PSI的去除［1］。根据目前所得到的证据，植物APs至少有3种加工方式，一种是类Procardosin A的方式，即在加工过程中，PSI先于前片段被去除，并且是完全去除，大量成熟蛋白在囊泡中聚集，因此推测其PSI的去除可能是在囊泡中通过自我剪切的方式来完成的［25］。第二种是类Prophytepsin的加工方式，在加工过程中Prophytepsin只有部分PSI被去除，而且代谢标记实验和免疫沉淀实验都显示，前片段先于PSI被裂解掉［18］，体外实验所获得的中间产物和最终产物与体内检测到的产物有些不同，因此推测phytepsin的成熟除了自激活机制外，可能还需要其他蛋白酶或裂解酶的辅助［26］。第三种加工方式类似于毕赤酵母中重组cyprosin的激活，其前体通过切除前片段和大部分的PSI形成不同形式的中间产物，成熟cyprosin的重链和轻链通过二硫键结合在一起，人们推测该二硫键可能是由宿主细胞中的其他蛋白酶催化形成的，而非cyprosin的自激活方式［27］。对于植物APs的加工，除上述3种方式外也许还存在其他的加工形式，但这些需要人们有更多的实验数据来证明。

根据prophytepsin三维结构，Kervinen等［13］提出一个植物APs灭活的机制，该机制类似于动物胃蛋白酶酶原的钝化机制。在胃蛋白酶的前体中催化活性位点被前片段所阻挡，而在prophytepsin中，催化活性位点不仅被前片段所阻挡，成熟酶N端的13个氨基酸残基也参与了阻挡［28］。前片段和N端氨基酸通过离子键与活性位点裂口处的Lys11/Tyr13相结合，阻挡了位于裂口底部的活性位点与底物的结合，从而阻止催化过程的发生［28］。很多植物APs都含有一个与prophytepsin Lys11/Tyr13位置相似的Lys/Tyr序列，如刺苞菜蓟中的cyprosin，暗示着可能存在相似的钝化机制。然而，cardosin A、cardosin B的前片段和成熟酶的N端不存在上述序列，而且生化研究显示，重组 procardosins 是有活性的［1］。这些实验结果证明植物APs还存在其他模式的灭活机制。

4 植物APs基因的多样化

随着基因组测序技术的提高，越来越多的植物APs基因被人们检测到［5］，在拟南芥基因组中，大约有69个编码天冬氨酸蛋白酶的基因［29］，在水稻基因组中，人们检测到96个AP样基因［30］，在葡萄基因组中，大约有50个AP样基因［31］。另外，在刚刚测序完成的3个麦属物种中也找到多个编码AP的基因，如大麦中有50多个，小麦A基因组中有70多个，小麦D基因组中也有50多个（文章待发表）。比较有趣的是，在人类基因组中只有8个基因编码AP［32］，线虫中有12个编码AP的基因［33］。可见，在动植物分离后，植物基因组中AP基因家族进行了大规模的扩增。通过对水稻中APs基因的染色体定位分析发现，水稻中的96个AP基因，93个能找到其在染色体上的物理位置，大约36个基因在染色上成簇存在，23个基因形成12对分布于染色体上，因此推测可能是基因的串联重复和染色体的片段重复促进了水稻AP基因家族的扩增［30］。对水稻APs基因的组织表达定位分析发现其在根、茎、叶、花粉和种子等多个组织中表达，其亚细胞定位分析也显示在细胞内和细胞外都有定位，因此推测植物APs基因的功能也发生了多样化。但是关于其功能多样化的机制还不是很清楚。

5 植物APs的功能

虽然很多植物中都检测和纯化到了APs，但是对于其功能的了解并不像动物和微生物中那样清楚。近些年，随着模式植物拟南芥和水稻基因组测序的完成，以及基因突变体库的建立，人们利用遗传学手段，对部分植物APs的功能进行了详细研究。总的来说，植物APs主要在以下几个生理过程中发挥着重要的作用，即防御反应、有性生殖过程、衰老和程序性死亡以及蛋白质的储存和降解。

5.1 胁迫反应

植物在生长发育过程中可能会受到病原菌、干旱、洪涝、盐碱等多种生物和非生物因子的胁迫，实验证明植物APs在两种胁迫反应中都发挥着重要作用。如拟南芥和水稻中的CDR1（Constitutive disease resistance）过表达能提高植株对病原菌的抵抗［10，11］，而拟南芥中的AED1与CDR1的功能相反，对系统获得性抗病能力起抑制的作用［34］。土豆中的StAP1和StAP3对病原菌有毒害作用［35］，同时还能引起人类Jurkat T 细胞的凋亡，这使其有可能用于癌症的治疗［36］。拟南芥中的ASPG1是植物APs参与非生物胁迫的一个典型例子，ASPG1只在保卫细胞中表达，当植物受到干旱胁迫时，ABA诱导ASPG1表达，ASPG1关闭气孔防止水分流失，同时激活抗过氧化物酶以保护拟南芥免遭过氧化物的伤害［37］。除此之外，人们在菜豆［38］、菠萝［39］、荞麦［40］等物种中鉴定到一些响应非生物胁迫的天冬氨酸蛋白酶，证明该类酶帮助植物积极的应对可能遇到的逆境胁迫。

5.2 有性生殖

Huang等［41］在水稻中鉴定到一个天冬氨酸蛋白酶OsAP65，亚细胞定位结果显示该蛋白定位于细胞内的囊泡中，该基因的缺失导致花粉萌发和花粉管的生长受到抑制，最终导致雄配子体的败育。另外，在拟南芥花粉萌发产生的分泌蛋白中，也鉴定到一个天冬氨酸蛋白酶，后期的遗传学实验证明，该基因的缺失降低了花粉的萌发率，暗示着该基因也参与了拟南芥的有性生殖过程［42］。

5.3 衰老和程序性死亡

烟草中的CND41基因编码一个不含PSI的非典型的AP，该蛋白定位于质体，能够降解叶片中的Rubisco，且降解产物作为氮源提供给新生组织［43］。CND41的突变使得烟草叶片推迟衰老，因此推测CND41可能通过降解质体中的蛋白来参与植物的衰老过程［43］。

最近有很多实验证明植物APs参与了细胞的程序性死亡，如拟南芥中的PCS1，PCS1的功能缺失使得植物细胞过度死亡，不能形成有活性的花粉，胚胎也不能正常的发育；而PCS1的过度表达又使得花药的裂口和隔膜处的细胞不能正常死亡，推迟了花药的开裂，不能实现受精过程［44］，因此PCS1的表达水平对拟南芥的正常发育至关重要［45］。最近，张启发课题组发现控制籼稻与粳稻杂种不育的S5位点的 ORF5基因编码一个天冬氨酸蛋白酶，该基因能够引起内质网的胁迫，使得未成熟的细胞提前进入程序性死亡，最终导致植物败育［46，47］。

5.4 蛋白的加工和降解

植物APs参与蛋白质的加工和成熟在很早的时候就有报道，如蓖麻种子中的AP在体外能够对pro2S白蛋白的前肽进行部分加工，亚细胞定位实验显示二者共定位于蛋白储存囊泡中，因此有人提出蓖麻子的APs可能参与了pro2S白蛋白前体的成熟过程［48］。类似的结果在拟南芥种子中也有报道［49］。

植物APs对蛋白质的降解，最典型的例子就是食虫植物中的APs，如猪笼草，其AP分泌到消化罐中降解捕获的昆虫，降解产物则为其生长提供所需要的氮源［50，51］。除此之外，在种子萌发过程中，植物APs会通过降解储备蛋白促进种子的萌发［52］。例如，星苞矢车菊中的AP主要在种子开始萌发时才开始表达，因此推测其功能可能主要是降解储备蛋白以供萌发需要［53］。

6 展望

近年来，关于植物APs的研究取得了很大的进展，尤其是在植物APs的功能研究方面，通过遗传学实验证明其在植物的很多生理过程中发挥着重要的作用。但是还有很多问题尚未解决，如与动物相比，植物中的APs是如何实现功能多样化的，植物APs的靶蛋白是什么，如此多的APs又是如何区分识别各自的靶蛋白的，对于这些问题的回答需要更多的研究，而回答好这些问题将有助于进一步认识植物APs对植物生长发育的调节作用，为提高农业生产奠定理论基础。

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（责任编辑狄艳红）

Research Advances on Plant Aspartic Proteinase

GE Wei-na LI Chao ZHANG Jia-qi ZHANG Lan WANG Zhen-yi
（College of Life Sciences，North China University of Science and Technology，Tangshan 063009）

Aspartic proteinases constitute one of four super-families of proteolytic enzymes， and are widely distributed in varied living organisms and involved in many biological processes. Compared with other organisms， the research on plant aspartic proteinases is relatively lagging behind. Since the end of last century， significant progress has been made in this area. Except conserved proteinase domain， typical plant aspartic proteinases have a specific insert only in plant. After the separation of plant and animal， the gene family of aspartic proteinases has expanded largely；these proteinases play important role in whole progress of plant growth and development， especially in stress response， sexual reproduction， senescence and programmed cell death， and the processing and degradation of protein. In this context， the research advances in plant aspartic protease is reviewed and its future development is prospected.

aspartic proteinase；processing and inactivation mechanism；stress response；sexual reproduction；programmed cell death

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.003

2015-03-27

唐山市科技计划项目（14130274a），河北联合大学培育基金（GP201304），河北联合大学博士启动基金（2710101150）

葛伟娜，女，博士，讲师，研究方向：蛋白质组学、生物信息学；E-mail：gwn-06@163.com