20个紫花苜蓿品种的ISSR遗传多样性分析

李杉杉，毛培春，郭静雅，郭　强，田小霞，孟　林

(北京市农林科学院 北京草业与环境研究发展中心，北京　100097)



20个紫花苜蓿品种的ISSR遗传多样性分析

李杉杉，毛培春，郭静雅，郭强，田小霞，孟林

(北京市农林科学院 北京草业与环境研究发展中心，北京100097)

采用ISSR分子标记技术，对来自美国、加拿大、澳大利亚和荷兰等4个国家的20个紫花苜蓿品种进行遗传多样性和亲缘关系分析。结果显示：从100条ISSR引物中筛选出10条带型清晰、多态性较好的引物，共扩增出75条带，其中62条呈多态性条带，多态性比率(PPB)为82.67%。20个紫花苜蓿品种的遗传相似性系数为0.60～0.87，平均为0.75，其中Algonquin与Phabulous之间的遗传相似性最高，达0.87，Sanditi，WL232和4020品种间，以及32IQ和Sequel品种间的遗传相似性最低，均为0.60。UPGMA聚类分析结果可将20个紫花苜蓿品种划分为6大类群，充分说明其具有丰富的遗传多样性。

紫花苜蓿；ISSR；遗传多样性；聚类分析

紫花苜蓿为多年生豆科牧草，具有高产、抗旱、耐寒、耐盐碱的特性[1]，因其适口性好、营养价值高，有“牧草之王”的美誉[2]。苜蓿自西汉传入我国已有2000多年的栽培历史[3]，目前我国的苜蓿产业正处于快速增长期，苜蓿在生态环境治理和草牧业健康发展中具有极其重要的作用[4]。对苜蓿遗传特性和遗传规律的研究是苜蓿产业健康稳步发展的重要基础，特别要明确不同苜蓿品种之间的遗传多样性和亲缘关系，可为苜蓿种质资源合理利用和新品种选育奠定重要的科学基础。

ISSR分子标记技术是利用微卫星序列作为PCR引物进行多位点扩增，以此来识别重复序列并对序列在不同基因组中的分布进行评估[5]。该技术克服了RAPD技术重复性不理想，AFLP技术复杂、费用高和SSR技术需要通过预知基因组序列来设计引物的缺点[6]，其技术简单快捷被运用到许多植物研究领域[7]。利用ISSR分子标记技术在燕麦(Avenasativa)[8]、大豆(Glycinemax)[9]、甜菜(Betavulgaris)[10]、丽穗凤梨(Vriesea)[11]、烟草(Nicotianatabacum)[12]等植物的遗传多样性及亲缘关系的研究中均取得了较好的结果。目前采用ISSR技术对苜蓿指纹图谱构建[13]、苜蓿种质材料亲缘关系及遗传多样性[14-16]的研究也有报道。此次研究利用ISSR分子标记技术，对收集到的来自4个国家20个紫花苜蓿品种的遗传多样性进行分析，阐明其亲缘关系，旨在为苜蓿后续育种工作和发掘优异等位位点提供理论依据。

1　材料和方法

1.1试验材料

以收集自美国、荷兰、加拿大和澳大利亚等4个国家的20个紫花苜蓿品种为试验材料(表1)。

1.2基因组DNA提取及检测

20份紫花苜蓿种子分别播种于花盆中，于室温下25～28℃培养，出苗后每份材料随机取10～15个单株的幼叶0.5 g，等量混合，根据TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit 试剂盒方法提取各个苜蓿品种基因总DNA，并利用0.8%的琼脂糖凝胶电泳及核酸蛋白仪对DNA的质量及浓度进行检测。将提取的DNA稀释至20 ng/μL，于-20℃保存备用。

表1　供试材料及来源

1.3苜蓿ISSR反应体系的优化

PCR扩增选用的引物是根据British Columbia 大学公布的100条ISSR引物序列由上海生工有限公司合成；PCR试剂盒购自大连宝生物公司。扩增程序为：94℃，2 min；94℃，20 s，55℃，30 s，72℃，1 min 30 s，30 cycle；72℃，7 min；4℃，保存。加样体系为：10×loading，buffer 2μL；MgCl2，1.2 μL；引物(0.5OD)，1 μL；dNTP，1 μL；Taq酶，0.2 μL；DNA模版，1 μL；ddH2O补齐20 μL。

1.4PCR扩增及电泳检测

于BIO PCR仪上进行PCR扩增。用1.4%琼脂糖凝胶检测扩增产物，并于凝胶成像系统下拍照。

1.5遗传相似性分析

电泳图谱中的每个条带均被认为1个分子标记，表示1个引物的结合位点。选取100～2 000 bp内的PCR扩增片段进行统计分析，根据有无条带统计于表格中，有带记作1，无带或不清晰条带记为0，生成各材料的0，1矩阵；利用NTSYSpc 2.10s软件中的UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic averages) 构建20个苜蓿品种的遗传关系树状图，分析其遗传关系。

2　结果与分析

2.1琼脂糖凝胶电泳结果

从100条ISSR引物中筛选出10条带型清晰、多态性较好的引物，并对20个紫花苜蓿品种进行PCR扩增，扩增后进行琼脂糖凝胶电泳并在凝胶成像仪上观测、照相。图1显示了引物864对20个紫花苜蓿品种的扩增结果。

图1　引物864的扩增结果Fig.1　Result of PCR amplification using primer 864 注：M-DL2000 DNA Marker；1-Sanditi；2-32IQ；3-42IQ；4-Alfa queen；5-Derby；6-Sardi7；7-Sardi10；8-Sitel；9-Aurora；10-Sequel；11-5s43；12-AC caribou；13-Spyder；14-Magna；15-4030；16-WL232；17-4020；18-Algonquin；19-Phabulous；20-3010

2.2ISSR-PCR多态性分析

对扩增后的电泳条带进行统计分析，ISSR扩增条带均位于200～2 000 bp。10条ISSR引物共扩增出75条带，平均每个引物扩增条带数为7.5条，其中有62条具有多态性，多态性比例(PPB)为82.67%(表2)，充分说明供试紫花苜蓿遗传资源的遗传多态性较为丰富，ISSR标记可以很好地揭示供试紫花苜蓿种内的遗传差异和亲缘关系。

2.3遗传相似性分析

根据ISSR所得数据对20个紫花苜蓿品种之间的遗传相似性系数(GS)分析评估，结果表明，20个紫花苜蓿品种的遗传相似系数(GS)为0.60～0.87，平均约为0.75，主要集中在4个区域：即0.82～0.87、0.78～0.82、0.74～0.78和0.67～0.74(表3)。其中Algonquin与Phabulous之间的遗传相似性最高，为0.87，Sanditi与WL232、4020以及32IQ和Sequel之间的遗传相似性最低，均为0.60。说明20个紫花苜蓿品种之间的遗传相似性系数变幅较大。

表2　20个苜蓿品种ISSR引物及其扩增结果

表3　20个苜蓿品种的遗传相似系数

2.4聚类分析

根据遗传距离采用UPGMA类平均法进行聚类分析，建立聚类分支树状图(图2)，在GS为0.74处，将20个紫花苜蓿品种明显划分为6大类群：第1大类群包含Sanditi和Alfa queen品种。第2大类群由12个品种组成，分为两个亚类，其中Derby和Sardi7首先聚在一起，后与42IQ聚在一起共同组成了I亚类的一个分支，Aurora、Sequel与5s43聚在一起组成了Ⅰ亚类的另一分支；第Ⅱ亚类的第1个分支是由Spyder和Magna先聚在一起后又与3010品种相聚组成的，另一个分支则是由Algonquin与Phabulous先聚在一起后再与4020品种聚在一起共同组成，说明Algonquin与Phabulous、Aurora与Sequel、Spyder与Magna之间的亲缘关系较近。第3大类群由4030和WL232品种组成。第4大类群包括Sardi10和Sitel品种。AC caribou和32IQ分别单独聚为一类，构成第5和第6大类群，说明两者遗传差异相对较大。

图2　20个苜蓿品种的UPGMA遗传距离聚类图Fig.2　UPGMA clustering of 20 alfalfa varieties based on genetic distance

3　讨论

种质资源是遗传改良的基础，只有了解种质资源遗传变异信息及亲缘关系的远近，才能有目的地选配亲本，培育出优良品种[11]。近年来，分子标记技术被大量应用于苜蓿遗传多样性的研究中，刘青松等[1]、蒿若超等[17]、李拥军等[16]、魏瑧武等[13]、张颖娟等[16]、姜健等[19]分别采用RAPD，SSR和ISSR等分子标记技术对苜蓿进行分子遗传多样性分析，研究得到的谱带多态位点比率在77.7%～98.8%。

紫花苜蓿为异花授粉植物，且自交严重衰退无法培育纯合品种，迄今为止全世界绝大多数紫花苜蓿品种均是通过表型轮回选择或大量自然选择培育出来的综合品种(群体)，这就造成部分育成品种间或多或少存在一定的亲缘关系[20]。姜健等[19]认为苜蓿种质资源的遗传多样性与地理位置及亲本的血缘关系密切相关。研究中Algonquin和Phabulous的遗传距离最近，Sanditi与WL232和4020之间的遗传距离最远，因此，推测Algonquin与Phabulous具有较近的亲缘关系，是否可能由于地理位置较近而具有相同或相近的亲本，而后者是否可能因地理来源的缘故而导致遗传距离较大。不同遗传背景的品种间的杂交可能会产生明显的杂种优势[21]。研究发现Sanditi与WL232和4020品种间的亲缘关系较远，其与这两个品种杂交可能会产生较大的杂种优势，此外，32IQ与其他品种的遗传距离也较大，因此推测它与其他19个紫花苜蓿品种杂交也会产生较大的杂种优势。

刘青松等[1]通过试验认为，聚为一类的大多是来源相同或相近的苜蓿品种，说明来源相同的苜蓿品种表现为较近的亲缘关系。研究结果显示，4030与WL232品种聚在一起，说明它们具有较近的亲缘关系以及相似的遗传背景，应当在品质及适应性等方面具有相似的特性，这与李岩等[22]的研究结果较为一致。同时，研究得出Sanditi，Sitel和Magna分别与Alfa queen，Sardi10和Spyder聚在一起，因此，推断后三者可能也具有前面三者较为相似的遗传特性。通过对20个紫花苜蓿品种的ISSR遗传多样性的分析，可为深入系统挖掘紫花苜蓿优异等位基因和培育新品种奠定科学基础。

4　结论

通过10条ISSR引物共在20个苜蓿品种中扩增出75个清晰可辨的位点，其中，有62个具有多态性，其多态位点率达到82.67%，说明苜蓿在其遗传进化过程中基因组DNA发生了丰富的变异。

研究中Algonquin和Phabulous的遗传距离最近，Sanditi与WL232和4020之间的遗传距离最远，因此推测Algonquin与Phabulous具有较近的亲缘关系。Sanditi与WL232和4020品种间的亲缘关系较远，其与这两个品种杂交可能会产生较大的杂种优势，此外，32IQ与其他品种的遗传距离也较大。4030与WL232品种聚在一起，说明它们具有较近的亲缘关系以及相似的遗传背景。

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Analysis of genetic diversity of 20 alfalfa varieties using ISSR molecular markers

LI Shan-shan,MAO Pei-chun,GUO Jing-ya,GUO Qiang,TIAN Xiao-xia,MENG Lin

(BeijingResearchandDevelopmentCenterforGrassandEnvironment,BeijingAcademyofAgricultureandForestrySciences,Beijing100097，China)

In this paper,the genetic diversity of 20 alfalfa (Medicagosativa)varieties from America,Canada,Australia and Netherland were studied using inter-simple sequence repeat (ISSR) molecular markers in order to provide the scientific basis for analyzing the genetic diversity and genetic relationship of alfalfa.Sixty two polymorphic bands were amplified with 10 effective primers selecting from 100 ISSR primers,and the average percentage of polymorphic bands was about 82.67%.The value of genetic similarity (GS) indexes among those 20 alfalfa varieties varied from 0.60 to 0.87,and the average GS value was about 0.75.The GS value between Algonquin and Phabulous was the highest about 0.87.But the GS value between the varieties of Sanditi and WL232,4020,between the varieties of 32IQ and Sequel was the lowest,only about 0.60,respectively.These 20 alfalfa varieties were classified into 6 groups using the UPGMA cluster analysis method.Therefore,the results showed that 20 alfalfa varieties had the higher level of genetic diversity,and which would provide a theoretical basis for the genetic characteristics of alfalfa germplasm resources and the breeding of new varieties.

alfalfa；ISSR；genetic diversity；cluster analysis

2015-09-21；

2016-05-10

北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX20140103)；国家国际科技合作专项项目(2015DFR30570-6)资助

李杉杉(1986-)，女，山东青岛人，硕士研究生。

E-mail：lss117@126.com

S 541

A

1009-5500(2016)04-0001-06

孟林为通讯作者。