茜草炭抗雌二醇致大鼠出血倾向的活性部位研究△

薛露，王海丽，肖林焱，陈毅，单鸣秋，张丽，丁安伟

(南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023)

·基础研究·

茜草炭抗雌二醇致大鼠出血倾向的活性部位研究△

薛露，王海丽，肖林焱，陈毅，单鸣秋，张丽，丁安伟*

(南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023)

目的：考察茜草炭各极性部位对子宫出血模型大鼠的止血作用。方法：空白组与其余各组分别灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、戊酸雌二醇(2.5 mg·kg-1)，连续灌胃3周，以宫血宁为阳性药，对照组及模型组灌胃(ig) CMC-Na，阳性组、石油醚提取物组、乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组和萃取剩余部位组分别ig相应的治疗药物，观察茜草炭各极性部位对子宫出血模型大鼠血液流变学、组织形态学、血小板系统和凝血系统的影响。结果：与空白组比较，模型组大鼠各切变率下的全血黏度降低(P<0.01)，TT、PT、APTT延长(P<0.05、0.01)，FIB、6-keto-PGF1α含量与ADP%升高(P<0.01)，6-keto-PGF1α/TXB2比值升高(P<0.01)，TXB2含量降低(P<0.01)。与模型组比较，乙酸乙酯提取物组和正丁醇提取物组能显著改善模型大鼠全血黏度(P<0.05，P<0.01)，缩短TT、PT、APTT (P<0.05，P<0.01)，减低FIB、6-keto-PGF1α含量(P<0.05，P<0.01)，乙酸乙酯提取物组显著升高TXB2含量(P<0.05)；石油醚提取物组和萃取剩余部位组均与ADP%具有改善模型大鼠全血黏度、缩短TT、APTT与PT，降低FIB和ADP%，降低TXB2含量与6-keto-PGF1α含量的趋势。结论：茜草炭乙酸乙酯提取物和石油醚提取物主要通过降低全血黏度、改善凝血功能以及促进血小板聚集功能发挥止血作用，为茜草炭止血有效部位。

茜草炭；止血；子宫出血；有效部位

茜草是茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根和根茎，主要用于治疗吐血，衄血，外伤出血，跌扑肿痛，关节痹痛，崩漏及瘀阻经闭等[1]；茜草炒炭后寒性减弱，涩性增加，止血功效增强[2]，临床主要用于治疗由瘀血阻滞而引起的各种出血症[3]。茜草炭现代研究较少，研究方向集中在炮制前后化学成分以及药理作用变化，药理研究多在正常动物身上进行，割裂了中医“病症”与中药及其炮制品之间的关联性，孤立地去评价药物。且现代研究成果无法完全揭示茜草炭止血的物质基础及作用机制，前期研究发现茜草对子宫出血模型大鼠有较好的治疗作用[4-5]，且茜草炭的止血功效强于茜草[6-7]，本实验旨在对茜草炭进行初步分离，在子宫出血大鼠模型上从凝血功能、血小板功能、血液流变学及组织形态学等方面考察茜草炭各极性部位的止血作用，筛选出茜草炭止血活性部位，为研究其止血活性成分及作用机制提供一定的依据。

1 材料

1.1仪器

HANGPINGFA1104N型十万分之一电子分析天平；SA-5000半自动血流变测试仪(北京中勤世帝科学仪器有限公司 )；LG-PABER半自动凝血分析仪 (北京中勤世帝科学仪器公司)；离心机(上海安亭科学仪器厂)；352型酶标仪(芬兰LabsystemsMultiskanMS)；Waterse2695超高效液相色谱仪，包括四元溶剂泵，自动进样器，光电二极管阵列检测器(DAD)。

1.2试剂

枸橼酸钠 (批号：F20110506)、羧甲基纤维素钠(批号：20140806)、水合氯醛(批号：20150126)，均购自国药集团化学试剂有限公司。凝血四项试剂盒：凝血酶时间(TT，批号：STY20301-52)、凝血酶原时间(PT，批号：STY20101-89B)、血浆纤维蛋白原(FIB，批号：STY20401-63)、活化部分凝血活酶时间(APTT，批号：STY20201-59)，均购自北京中勤世帝科学仪器公司。ADP(北京中勤世帝科学仪器公司，ADP粉剂1瓶，ADP缓冲液10mL/瓶) 。ELISA试剂盒：6-酮-前列腺素(6-keto-PGF1α，批号：SBJ-R0532)、血栓素(TXB2，批号：SBJ-R0548)均购自南京建成生物科技有限公司。

1.3药品

茜草购自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，经南京中医药大学吴启南教授鉴定为茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根和根茎。茜草炭按2015年版《中华人民共和国药典》(一部) 有关要求炒制而成。宫血宁胶囊(批号：Z20020087，云南白药集团股份有限公司)；戊酸雌二醇片(批号：ZBA1501，DELPHARM Lille S.A.S)。羟基茜草素(批号：81549，南京森贝伽科技技术有限公司)，大叶茜草素(批号：110884-200604，中国食品药品检定研究院)，茜草素(批号：A0317926，赛默飞世尔科技公司)，异茜草素、1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌、1-羟基-2-甲基蒽醌均为自制，经HPLC 检测纯度>98%。

1.4动物

SPF级SD雌性大鼠，4周龄，体重70g左右，由浙江省实验动物中心提供，合格证号：SCXK(浙)2014-0001。

2 方法

2.1溶液的制备

2.1.1混合对照品储备液 精密称取对照品茜草素、羟基茜草素、1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌、甲基异茜草素、1-羟基-2-甲基蒽醌、大叶茜草素适量，加甲醇溶解，制成异茜草素、羟基茜草素、1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌、甲基异茜草素、1-羟基-2-甲基蒽醌、大叶茜草素质量浓度分别为50.07、34.40、34.22、32.69、33.16、53.62mg·L-1的混合对照品储备液。

2.1.2供试品溶液 茜草炭各极性提取物：取茜草炭500g，加10倍量95%乙醇加热回流提取两次，每次2h，残渣加10倍量水加热回流提取2次，每次2h，合并四次滤液浓缩，将浓缩液依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等倍萃取10次，回收各溶剂，减压干燥至恒重，这4个部位的浸膏得率分别为石油醚提取物1.00%、乙酸乙酯提取物1.72%、正丁醇提取物2.09%、萃取剩余部位13.09%。临用前以0.5%CMC-Na溶液将茜草4种极性部位研匀并稀释至实验所需浓度。

2.2色谱条件

色谱柱：AcquityBEHC18色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；柱温：30℃；进样量：2μL；检测波长：296nm；流动相：A为0.3%甲酸水，B为甲醇，(A∶B)0～4min(90∶10→65∶35)，4～9min(65∶35→40∶60)，9～15min(40∶60→30∶70)，15～20min(30∶70→10∶90)，20～22min(10∶90→90∶10)。

2.3子宫出血鼠模型的复制

将SD大鼠置于室温(25±2) ℃、相对湿度(50±15)%的实验室中饲养，12h明暗交替，正常摄食饮水。空白组与模型组分别灌胃(ig)给予0.5%CMC-Na、戊酸雌二醇(2.5mg·kg-1)，连续灌胃3周，并于第三周连续镜检观察模型组大鼠阴道脱落上皮细胞涂片，对角化率呈周期性变化的大鼠进行剔除[8]。

2.4动物分组及给药

对在全周期(3周)持续外源性雌激素的干预后没有性周期的大鼠随机分为模型组、阳性组、石油醚提取物组、乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组和水提取物组[9]，空白组即为造模时的空白组。空白组与模型组灌胃给予0.5%CMC-Na，阳性组ig给予宫血宁0.156g·kg-1，石油醚提取物组、乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组和萃取剩余部位组分别ig给予相应的供试液(临床给药剂量为10g，取临床剂量的2倍量，按照人体和大鼠等效剂量换算，茜草炭不同提取物给药剂量均为含生药量2.5g·kg-1)，根据文献研究及前期工作发现此剂量为止血有效剂量[10]。连续给药8d。

2.5指标测定

第8天，各组正常给药40min后，各组大鼠10%水合氯醛麻醉，颈总动脉取血，以3.8%枸橼酸钠1∶9抗凝，1mL全血分装测定全血高、中、低切黏度，剩余全血以800r·min-1离心10min，得富血小板血浆(PRP)，测定ADP诱导的血小板聚集率；余血再以3000r·min-1离心10min，得贫血小板血奖(PPP)，测定内/外源性凝血功能指标(TT，PT，APTT，FIB)，ELISA法测定TXB2、6-keto-PGF1 α。2.6统计学方法

3 结果

3.1色谱比较

茜草炭各极性部位主要化学成分分别为：石油醚提取部位主要含有羟基茜草素和1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌；乙酸乙酯提取部位主要含有茜草素、羟基茜草素、1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌、甲基异茜草素和大叶茜草素；正丁醇提取部位主要含有羟基茜草素、大叶茜草素和1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌；萃取剩余部位主要含有羟基茜草素，从各成分含量上来看，蒽醌类成分主要集中在乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位。茜草各对照品色谱图见图1，茜草各极性部位化学成分含量见表1。

注：1.茜草素；2.羟基茜草素；3.1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌；4.甲基异茜草素；5.1-羟基-2-甲基蒽醌；6.大叶茜草素。图1 茜草各对照品色谱图

化学成分含量(%)石油醚提取组乙酸乙酯提取组正丁醇提取组萃取剩余部位组茜草素0.0882±0.000260.2000±0.009200.0692±0.000620.0089±0.00030羟基茜草素0.5455±0.000422.3871±0.000500.3449±0.000400.1285±0.000571,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌0.1113±0.003061.1632±0.004140.2506±0.000210.0334±0.00031甲基异茜草素0.0977±0.000490.2039±0.000470.0135±0.000420.0014±0.000471-羟基-2-甲基蒽醌0.0896±0.000100.0717±0.00050大叶茜草素0.0019±0.000150.1013±0.000510.1836±0.00057

3.2对子宫脏器指数的影响

与空白组比较，模型组显著降低脏器指数(P<0.01)。与模型组比较，阳性组、石油醚提取物组、乙酸乙酯提取物组以及正丁醇提取物组均显著升高模型大鼠的脏器指数(P<0.05或P<0.01)，萃取剩余部位组具有升高脏器指数的趋势，但作用不显著。其中乙酸乙酯提取物组和正丁醇提取物组影响最显著，石油醚提取物组作用次之。结果见表2。

表2 茜草炭不同极性部位对脏器指数的影响

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P< 0.05，△△P<0.01；下同。

3.3对血液流变性的影响

与空白组比较，模型组全血高、中、低切黏度均显著降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性组和乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组均可以升高模型组大鼠高、中、低切黏度(P<0.05，P<0.01)；茜草炭萃取剩余部位组可显著升高模型大鼠的高、中切黏度(P<0.05)，有升高低切黏度的趋势；茜草炭石油醚提取物组有升高模型大鼠高、中、低切黏度趋势，均无统计学差异。结果见表3。

3.4对凝血四项的影响

与空白组比较，模型组可显著延长TT、PT、APTT，增加FIB含量(P<0.01)。与模型组比较，阳性组显著缩短TT、PT、APTT，降低FIB含量(P<0.05或P<0.01)；茜草炭乙酸乙酯提取物组和正丁醇提取物组可显著缩短TT、PT、APTT，降低FIB含量(P<0.05或P<0.01)，茜草炭石油醚提取物组可显著缩短APTT(P<0.05)，水提取物组可以显著降低TT和FIB(P<0.05或P<0.01)，茜草炭石油醚提取物组和萃取剩余部位组有缩短PT、降低FIB含量的趋势，但是作用不显著。结果见表4。

表3 茜草炭不同极性部位对子宫出血模型大鼠血液流变性的影响

表4 茜草炭不同极性部位对子宫出血模型大鼠TT、PT、APTT、FIB 的影响

3.5对血小板功能的影响

与空白组比较，模型组显著升高6-keto-PGF1α的含量(P<0.01)，降低TXB2含量和ADP%(P<0.01)，显著升高6-keto-PGF1α/TXB2的比值(P<0.01)。与模型组比较，阳性组可显著降低6-keto-PGF1α含量和6-keto-PGF1α/TXB2的比值以及增加ADP%(P<0.01)，显著升高TXB2含量(P<0.05)；茜草炭乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组和萃取剩余部位组可显著降低6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量(P<0.01)；石油醚提取物组有降低6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量的趋势，作用不显著；茜草炭乙酸乙酯提取物组和正丁醇提取物组显著升高TXB2含量(P<0.05)，茜草炭石油醚提取物组和萃取剩余部位组有升高TXB2的作用；茜草炭乙酸乙酯组和正丁醇组能显著增加ADP%(P<0.05)，茜草炭石油醚组和萃取剩余部位组有增加ADP%的趋势，但效果不显著。见表5。

表5 茜草炭不同极性部位对子宫出血模型大鼠TXB2、6-keto-PGF1α和 ADP%的影响

4 讨论

子宫内膜是对雌性激素最敏感的效应组织，未成年雌性大鼠在单一雌激素持续干预下使子宫蛋白质合成增加，子宫内膜增生，血管、间质、腺体发育不同步，内膜厚而不牢固，且不断增厚的子宫内膜对雌激素的需求也持续增加。当雌激素极速下降时发生雌激素撤退性出血，伴随纤维结缔组织增生，间质血管扩张，炎细胞浸润及子宫脏器系数下降[11-13]。且雌激素通过雌激素受体(ER)介导cAMP途径阻止细胞外Ca2+内流，并通过刺激血小板腺苷酸环化酶对血小板有解聚作用。天然雌激素戊酸雌二醇比传统雌激素更具有生物利用度高、治疗效果好、毒副作用轻、患者依从性强等优点。因此本实验将戊酸雌二醇用作造子宫出血模型的药物。实验中持续的戊酸雌二醇刺激而无孕激素对抗可造成大鼠血液黏稠度降低，血小板聚集率降低，凝血系统障碍，子宫内膜增厚，腺体密集，大量炎性细胞出现，伴有出血倾向，与文献中雌激素造子宫出血模型症状相符。茜草具有凉血止血、活血化瘀之功效，宫血宁胶囊为理血剂，具有凉血止血、清热除湿、化瘀止痛的功效，宫血宁胶囊主要原料为重楼[14]，重楼皂苷通过促进ADP诱导的血小板聚集作用，缩短出血和凝血时间而达到明显的止血效果[15]，与茜草止血途径类似。宫血宁胶囊还具有降低子宫出血量及缩短子宫出血时间等药理作用[16]，且临床研究表明[17]，患者口服宫血宁后均未发现任何毒副作用，故此实验选择宫血宁胶囊作为阳性药。根据本实验室前期研究以及预实验发现茜草炭用药剂量为2.5g·kg-1时(即临床两倍量，按照大鼠和人等效剂量换算的剂量)，对出血模型大鼠具有良好的止血作用，故本实验用此剂量[10]。

实验结果表明，茜草炭乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均可不同程度地改善子宫出血模型大鼠全血低黏状态、缩短TT、PT、APTT，降低FIB含量，通过影响内、外源性凝血途径达到止血作用。茜草炭各极性提取物均能提高ADP诱导的血小板聚集率，其中茜草炭乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物作用显著。6-keto-PGF1α由血小板释放，具有舒张血管和抑制血小板聚集作用，TXB2是6-keto-PGF1α的抑制物，具有收缩血管和促进血小板聚集作用。茜草炭乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均可以显著调节TXB2、6-keto-PGF1α使其达到平衡，增加大鼠血小板聚集率。综上茜草炭乙酸乙酯部位和正丁醇部位为其止血作用的功效部位，推测其止血作用的作用机制一方面通过降低全血黏度改善凝血系统障碍；另一方面减轻子宫内膜增厚，减少炎性细胞产生和间质充血现象，从而缓解组织形态学的破坏。据文献报道羟基茜草素具有抑制血浆透明质酸结合蛋白(PHBP)对凝血因子Ⅶ的激活作用[18]，是PHBP的特异性抑制剂。大叶茜草素对胶原诱导的兔血小板与花生四烯酸(AA)聚集有明显的抑制作用，且对血小板激活因子诱导的聚集也有一定的抑制作用[19]。研究发现异茜草素在茜草生品中含量极微，炮制成茜草炭以后，异茜草素含量增加，并且止血作用增强[20]。异茜草素有明显缩短小鼠凝血时间的作用，是茜草炭主要止血成分之一[21]。茜草炭中的蒽醌类成分主要集中在乙酸乙酯部位和正丁醇部位，推测乙酸乙酯部位和正丁醇部位的止血活性功效可能与羟基茜草素、大叶茜草素及异茜草素等蒽醌类成分有关。综合实验结果推测与茜草炭止血相关物质主要集中在乙酸乙酯和正丁醇提取物，主要通过影响内/外源性凝血系统、血小板系统、血液流变学等途径发挥止血作用，为茜草炭临床应用和进一步的物质基础、作用机制研究提供依据。

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StudyonActivePartsfromRubiaeRadixetRhizoma(carbonized)inRatswithEstradiolInducedBleedingTendency

XUELu，WANGHaili，XIAOLinyan，CHENYi，SHANMingqiu，ZHANGLi，DINGAnwei

(JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：To discuss the hemostasis of the different polarities of Rubiae Radix et Rhizoma (carbonized) on the dysfunctional uterine bleeding rat model.Methods：The SD rats were divided into seven groups.The rats in the control group were fed with CMC-Na for 3 weeks，the other groups were fed with estradiol valerate for 3 weeks.Gong Xue Ning was taken as the positive control drug.The rats in the control group and model group were fed with CMC-Na for 7 days，and the rats in other groups were fed with corresponding drugs simultaneously.The influence of the different polarities of carbonizedRubiacordifoliacompound to dyfunctional uterine bleeding (DUB) rat's hemorheology，coagulation system，fibrinolytic system，tissue morphology and platelet system.Results：Compared with the control group，the model group could reduce the whole b--lood viscosity in each shear rate (P<0.01) and prolong the TT，PT，APTT (P<0.05，P<0.01)，increase the FIB，6-keto-PGF1αcontent and ADP%(P<0.01)，and decrease the TXB2.Compared with the model group，ethyl acetate and butanol extract group could increase the whole b--lood viscosity in each shear rates (P<0.05，P<0.01)，shorten the TT，PT，APTT (P<0.05，P<0.01)，decrease the content of FIB，6-keto-PGF1αand ADP% (P<0.05，P<0.01)，and increase the TXB2，while petroleum ether and water extract groups gave no significant effect.Conclusion：Ethyl acetate extract is the active part of Rubiae Radix et Rhizoma (carbonized)，showing the effect of hemostasis by reducing the low whole blood viscosity，improving coagulation function mainly and ameliorating the function of platelet aggregation.

Rubiae Radix et Rhizoma (carbonized)，hemostasis，dysfunctional uterine bleeding，active parts

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.007

2016-04-21)

国家自然科学基金(81473348)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(ysxk-2014)；江苏高校品牌专业建设工程资助项目(PPZY2015A070)

*

丁安伟，博士生导师，教授，研究方向：中药质量标准与创新药物；Tel：(025)85811523，E-mail：awding105@163.com