阴坡、阳坡连翘及连翘叶中不同成分含量的比较△

王芳，白吉庆，黎丹，王小平，王金，胡锦苹

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

阴坡、阳坡连翘及连翘叶中不同成分含量的比较△

王芳，白吉庆，黎丹，王小平*，王金，胡锦苹

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

目的：比较阴坡、阳坡对连翘及连翘叶中不同成分含量的影响。方法：采用HPLC法测定连翘及连翘叶中芦丁、连翘酯苷A及连翘苷的含量，采用水蒸汽蒸馏法提取并测定连翘中挥发油的含量。结果：阴坡、阳坡连翘中挥发油、连翘苷和连翘酯苷A的含量差异均不明显；阴坡、阳坡连翘叶中芦丁、连翘苷的含量差异不明显，但连翘叶中连翘酯苷A的含量差异显著，阴坡含量高达10.0%以上，阳坡含量仅2.65%；连翘叶中主要成分的含量阴坡均高于阳坡；在同一坡向，连翘叶中连翘苷和连翘酯苷A的含量均高于连翘中含量，特别是连翘酯苷A的含量在连翘叶中几乎是连翘中9倍。结论：阴坡、阳坡对连翘中的主要成分的含量没有显著影响，而连翘叶中主要成分的含量阴坡高于阳坡，并且连翘叶中连翘酯苷A的含量阴坡、阳坡影响较大，有统计学意义。

阴坡；阳坡；连翘；连翘叶；连翘酯苷A

连翘为木犀科植物连翘Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实，具有清热解毒，消肿散结，疏散风热之功效[1]。其叶夏、秋季采集，鲜用或晒干，具有清热解毒之功效[2]。二者具有基本相同的化学成分[3]。现代药理研究表明，连翘及其叶具有抑菌、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗肝损伤、抗衰老、抑制癌细胞增殖等多种生物活性[4-9]。有研究表明，由于阴坡、阳坡植物土壤含水量、含氮、磷及有机物量的差异，植物生长和产量等均有所不同[10]，本实验取以阴坡、阳坡的连翘及连翘叶为研究对象，以挥发油、芦丁、连翘酯苷A和连翘苷的含量为评价指标，对阴坡、阳坡连翘及连翘叶进行比较分析，为连翘及其叶的进一步开发利用提供科学参考。

1 仪器与试药

101-2型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器设备有限公司)，赛多利斯BT125D型双量程电子分析天平(赛多利斯股份有限公司)，戴安UitiMate 3000 全自动高效液相色谱仪(二极管阵列检测器)。

连翘苷对照品(批号：110821-200711)；芦丁对照品(批号：080-9705)；

连翘酯苷A对照品(批号：111810-201103)；上述对照品均购自中国药品生物制品检定研究院。乙腈为色谱纯；水为纯化水；冰醋酸等为分析纯。

连翘及连翘叶于2013年7月、8月间采于陕西省铜川市耀州区小丘镇，每个样本数不低于3批，经陕西中医学院白吉庆副教授鉴定为木犀科植物连翘Forsythiasuspense(Thunb.)Vahl的果实及其叶。

2 方法与结果

2.1 药材处理

将采摘下的连翘及连翘叶60 ℃干燥至水分低于10.0%，取出，即得。

2.2 连翘中挥发油的测定[1]

取连翘粉末约30 g(过五号筛)，置圆底烧瓶中，加水300 ml与玻璃珠数粒，连接挥发油测定器与回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，以溢流入烧瓶为止，置电热套中缓缓加热至微沸，并保持5 小时至油量不再增加，停止加热，放置1 小时，再开启活塞使油层下降至其上端恰与刻度0平齐，读取挥发油量，并计算供试品中所含挥发油的含量(%)。

2.3 连翘中连翘苷与连翘酯苷A的含量测定[1]连翘苷

色谱条件与系统适用性试验 采用HPLC法，色谱柱为Hypersil GOLD C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈-水(25∶75)为流动相，体积流量1.0 mL·min-1，检测波长为277 nm，柱温为25 ℃。理论塔板数按连翘苷峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备 精密量取连翘苷对照品3.96 mg，置25 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。

供试品溶液的制备 取各样品粉末(过五号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15 mL，称定重量，浸渍过夜，超声25分钟，放冷，补足重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，蒸至近干，加中性氧化铝0.5 g拌匀，加在中性氧化铝柱上，用70%乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用50%甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取上述对照品溶液1、2、3、4、5、6、8、10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件分析测定，每个体积进样2 次，记录各对照品的峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，对照品质量为横坐标(X)进行线性回归，得回归方程：Y连翘苷=7.861X+0.09，r=1；结果表明连翘苷在0.16～1.90 μg线性关系良好。

测定法 精密吸取供试品溶液适量，注入液相色谱仪测定，代入上述回归方程计算，即得。

连翘酯苷A

色谱条件与系统适用性试验 采用HPLC法，色谱柱为Hypersil GOLD C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈-0.4%冰醋酸溶液(15∶85)为流动相，体积流量1.0 mL·min-1，检测波长为330 nm，柱温为25 ℃。理论塔板数按连翘酯苷A峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备 精密量取连翘酯苷A对照品4.76 mg，置50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。

供试品溶液的制备 取各样品粉末(过五号筛)约0.01 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇15 mL，称定重量，超声30 min，取出，放冷至室温，再称定重量，用70%甲醇补足重量，过滤，取续滤液，即为供试品溶液。

分别精密吸取上述对照品溶液1、2、3、4、5 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件分析测定，每个体积进样2 次，记录各对照品的峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，对照品质量为横坐标(X)进行线性回归，得回归方程：

Y连翘酯苷A=17.98X+0.088 7，r=0.999 8；结果表明连翘苷在1.77～8.58 μg线性关系良好。

测定法 精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各适量，注入液相色谱仪测定，代入上述回归方程计算，即得。

2.4 连翘叶中芦丁、连翘酯苷A与连翘苷的含量测定

2.4.1 色谱条件 采用HPLC法，色谱柱为Hypersil GOLD C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.4%冰醋酸溶液(B)为流动相进行梯度洗脱(0～8 min，10%～15%A；8～18 min，15%～22%A；18～25 min，22%～40%A；25～30 min，40%～95%A；30～35 min，95%～95%A)；流速为1.0 mL·min-1，检测波长为277 nm，柱温为30 ℃。理论塔板数按连翘苷峰计算应不低于3000。

2.4.2 对照品溶液的制备 分别称取连翘苷对照品、芦丁对照品和连翘酯苷A对照品适量，精密称定，置25 mL量瓶中，用甲醇制成每1 mL中含连翘苷0.08 mg、含芦丁0.108 mg、含连翘酯苷A 0.19 mg的溶液，即得。

2.4.3 供试品溶液的制备 取各样品粉末(过五号筛)0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15 mL，称定重量，超声提取40 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 测定法 分别精密吸取上述对照品溶液1、2、4、5、7、8、10 μL，注入液相色谱仪，按2.4.1项下色谱条件进行测定，每个体积进样2 次，以峰面积为纵坐标(Y)，对照品质量为横坐标(X)进行线性回归，得回归方程：Y芦丁=11.462X-0.196 2，r=0.999 9；Y连翘酯苷A=8.199 2X-0.018 9，r=0.999 9；Y连翘苷=6.914 3X+ 0.037，r=0.999 9；结果表明芦丁在0.108～1.08 μg，连翘酯苷A在0.19～1.90 μg，连翘苷在0.08～0.80 μg线性关系良好。

分别精密吸取上述供试品溶液适量，在上述色谱条件下进样，记录峰面积，代入上述回归方程计算，即得。见图1。

图1 标准品和连翘叶样品的HPLC图

2.4.5 方法学考察 精密度试验 精密吸取 2.4.2 项下对照品溶液5 μL，连续进样6次，各记录芦丁、连翘酯苷A、连翘苷峰面积，结果各峰面积的RSD分别为1.08%、1.13%、1.09%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验 精密吸取2.4.3 项下同一供试品溶液，于0、5、10、15、20 h 分别进样5 μL，记录芦丁、连翘酯苷A、连翘苷峰面积，结果各色谱峰面积的RSD分别为0.99%、0.82%、0.56%，表明供试品溶液在20 h内稳定性良好。

重复性试验 称取同一连翘叶粉末(过四号筛)5份，每份0.3 g，精密称定，按2.4.3 项下方法制备供试品溶液，分别进样5 μL，结果芦丁、连翘酯苷A、连翘苷百分含量的RSD分别为1.04%、1.27%、1.51%，表明重复性良好。

加样回收率试验 称取已知含量的同一连翘叶粉末(过四号筛)6份，每份约0.1 g，精密称定，然后分别精密加入适量的芦丁对照品、连翘酯苷A对照品、连翘苷对照品。按2.4.3项下方法制备供试品溶液，分别进样5 μL，结果见表1。

表1 连翘叶中芦丁、连翘酯苷A、连翘苷加样回收试验

2.5 结果

按上述方法检测连翘及连翘叶中相关成分的含量。结果如表2。

表2 测定结果

注：—表示未检测

由表2可知，阴坡、阳坡连翘中挥发油、连翘酯苷A和连翘苷的含量差异较小，分别在2.03%～2.96%、5.73%～7.84%和0.28%～0.53%之间；阴坡、阳坡连翘叶中芦丁和连翘苷的含量差异较小，分别在1.01%～1.57%和1.73%～3.71%之间，连翘酯苷A的含量含量差异较大，在2.65%～10.18%之间；阴坡连翘叶中主要成分的含量均高于阳坡；连翘叶中连翘酯苷A的含量几乎是连翘中9倍。

3 讨论

本实验通过对流动相、检测波长、柱温等条件的筛选，建立了同时测定连翘叶中芦丁、连翘苷和连翘酯苷A的含量的方法，比较了甲醇-水、甲醇-0.4%冰醋酸溶液、乙腈-0.4%冰醋酸和乙腈-水体系的等度和梯度洗脱，结果乙腈-0.4%冰醋酸溶液梯度洗脱时，所得色谱图基线平直，各待测成分的色谱峰分离度良好，且各待测成分在30 min内均已出峰，此方法实用、可靠。

本实验中连翘与连翘叶均同时采用2010版药典中连翘项下的含量测定方法(2.3项下方法)和2.4.1项下方法进行含量测定，结果采用2.4.1项下方法时连翘中芦丁分离度较差，影响其含量测定结果准确性，故连翘含量测定方法采用2.3项下方法；连翘叶采用2.4.1项下方法时，各待测成分分离度良好，色谱图基线平直，故连翘叶采用2.4.1项下方法对芦丁、连翘苷、连翘酯苷A进行了含量测定。

通过上述两种方法的比较，连翘叶中连翘苷与连翘酯苷A含量无显著性差异，而药典中连翘苷和连翘酯苷A分别建立了不同的检测方法，大大增加了检测成本和检测周期，本文建立的含量测定方法可同时测定连翘叶中芦丁、连翘苷和连翘酯苷A的含量，既降低了检测成本，又缩短了检测周期，该方法准确可靠、简单易行，可为下一步药典含量方法的制定提供借鉴依据。

通过比较，发现阴坡连翘叶中黄酮类成分和木质素类成分的含量较高于阳坡，这可能与阴坡、阳坡的土壤厚度、土壤pH值、含水率、有效磷、有效氮和有机质含量等差异[10]有关，而连翘酯苷A在阴坡、阳坡中的差距也可能与连翘酯苷A的稳定性[11]有关；在同一坡向，连翘叶中连翘苷和连翘酯苷A的含量均高于连翘中含量，特别是连翘酯苷A的含量在连翘叶中几乎是连翘中的9倍。这可能与有效成分在植物体不同部位的分布相关。

通过比较，发现不同生长期连翘叶中主要成分如连翘酯苷A含量差异较大，这可能与气候、阳光等多种生态因子有关，有待进一步考察分析。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：159-160.

[2] 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草：第十六卷[M].上海：上海科技出版社，1999：157-159.

[3] 陈玲，李晓，李倩，等.连翘属植物化学成分的研究进展[J].现代药物与临床，2013，28(3)：441-445.

[4] 秦臻，徐军，张立伟.连翘及连翘叶体外抑菌作用研究[J].食品工程，2013，6(2)：49-52.

[5] LIU J，YANG JX.Hypoglycemic Effect of Forsythia suspensa Leaves on Diabetic Mice [J].Agricultural Science & Technology，2013，14(1)：98-99，175.

[6] 雷秋香，赵连梅，颜晰，等.连翘叶乙醇提取物对人食管癌细胞增殖抑制作用的研究[J].肿瘤防治研究，2012，39(4)：394-399.

[7] 张淑蓉，裴香萍，闫艳，等.不同采收期青翘和连翘叶中活性成分的含量比较[J].中国药房，2011，22(31)：2940-2942.

[8] 李虹.中药连翘研究概况[J].中国民间疗法，2014，22(5)：92.

[9] 侯改霞，习雪峰，杨建雄.连翘叶提取物对力竭及恢复小鼠肝脏、骨骼肌的保护作用[J].现代预防医学，2011，38(2)：316-318.

[10] 张建军.生态因子及抚育对野生连翘生长和产量的影响[J].山西农业大学学报(自然科学版)，2013，33(1)：10-14.

[11] 王曙宾，郑亚杰.连翘提取物和连翘酯苷A原料中连翘酯苷A的稳定性研究[J].中草药，2010，41(6)：909-911.

ComparativeStudyonContentofConstituentsinFruitsandLeavesofForsythiasuspensaGrowingonShadeandSunnySlope

WANG Fang，BAIJiqing，LIDan，WANGXiaoping*，WANGJin，HUJinping

(ShaanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712046，China)

Objective：To compare the content of different constituents infruits and leaves ofForsythiasuspensagrowing on shady and sunny slope.Methods：HPLC was used to determine the content of rutin，forsythiaside A and phillyrin.The steam distillation was applied in the determination of volatile oil.Results：InF.suspensa，the content of volatile oil，forsythiaside A and phillyrin was not significant difference growing on shady and sunny slope；InF.SuspensaLeaves，the difference was insignificant of the content of rutin and forsythiaside A in shady and sunny slope.While a significant difference was existed in the content of forsythiaside A，the content of shady slope was as high as 9.0%，the content of sunny slope wass only 6.3%；The content of main components inF.Suspensaleaves in shady slope were higher than in sunny slope；In the same slope direction，the content of forsythiaside A and phillyrin inF.Suspensaleaves were higher thanF.suspensafruits，especially the content of forsythiaside A inF.Suspensaleaves was almost nine times inF.suspensafruits.Conclusions：Shady sunny slope has no significant effect on the content of the main ingredient inF.suspensafruits，while the content of main components inF.Suspensaleaves of shady slope was higher than that of the sunny slope，especially the content of forsythiaside A，with statistical significance.

Shady slope；sunny slope；Forsythiasuspensa；Forsythiasuspensaleaves；forsythiaside A

2015-06-10)

科技部项目(11C26216103652)；工业和信息化部项目([2012]369号)；陕西省科技厅项目(2014K14-01-01)；陕西省教育厅(2013JK0834)

*

王小平，教授，研究方向：中药质量评价及新药开发；Tel：(029)38185165，E-mail：wangxiaoping323@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.014