不同湿度贮藏条件下南方红豆杉多糖含量动态变化的研究△

陈发军，张春椿，余杨，熊耀康*

(1.丽水市科技局生产力促进中心，浙江 丽水 323000；2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053)

·中药农业·

不同湿度贮藏条件下南方红豆杉多糖含量动态变化的研究△

陈发军1，张春椿2，余杨1，熊耀康2*

(1.丽水市科技局生产力促进中心，浙江 丽水 323000；2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053)

目的：研究研究南方红豆杉枝条在不同湿度贮藏环境下多糖的含量变化，确定南方红豆杉多糖最佳贮藏湿度环境。方法：设置了65%RH、75%RH和85%RH三个贮藏湿度，通过测量不同湿度贮藏环境下南方红豆杉总多糖的含量变化，以确定最佳湿度贮藏条件。结果：南方红豆杉总多糖含量呈先升高后又开始下降的迹象，总多糖在0～3个月中65%RH﹥75%RH﹥85%RH。结论：南方红豆杉多糖成分最佳的贮藏环境是65%RH低湿环境。

南方红豆杉；多糖；湿度

南方红豆杉Taxuschinensisvar.mairei(Lemee et Levl.)Cheng et L.K.Fu系裸子植物亚门(Cymnospermai)、松杉纲(Coniferopside)、红豆杉目(taxales)红豆杉科(Taxaceae S.F.Gery) 中红豆杉族(TaxeaeMilchior et Werd)下属的红豆杉属(TaxusLinn)植物[1]，素有“植物黄金”之称[2]。据《本草纲目》记载：“性辛、味甘，具有解毒、散结、止痛等功效”[3]。主要分布于长江流域、南岭山脉[4]，其栽培品和和野生品的紫杉醇含量相当，所以可能成为生产紫杉醇的一个主要栽培种[5-6]。红豆杉内除了含有紫杉烷类有效成分，还含有多糖和黄酮[7]。现研究表明红豆杉多糖在肿瘤生长的抑制作用、对整体动物的耐受力的增强作用、对免疫低下小鼠的免疫功能提高作用和提高生命延长率等方面具有良好抗肿瘤活性[8]。按照目前的提取工艺，枝叶在提取紫杉醇后往往被丢弃，这样形成了极大的资源浪费。不同的贮藏环境下药材质量差异显著，湿度是众多环境因子中影响较为显著的因子。有研究指出红豆杉枝叶中紫杉醇含量为0.020 6%，多糖成分含量为1.54%～5.45%[9]，而南方红豆杉贮藏过程中的多糖的含量未见报道。寻找最佳贮藏条件，减少药材在贮藏过程中有效成分遗失，提高红豆杉药材质量至关重要。本文系统地研究采收后南方红豆杉带叶枝条在不同湿度贮藏环境下多糖的含量变化，确定南方红豆杉多糖最佳贮藏湿度环境，从资源保护的角度使得南方红豆杉药用植物资源能够得到充分的开发应用，为建立南方红豆杉的贮藏环境要求提供理论依据和坚实基础，为丰富其资源利用奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Spectrumlab22可见分光光度计(上海楼光技术有限公司)、AB135-S电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)、KQ5200超声清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)等。

1.2 药材

本文采用的南方红豆杉药材均由宁波泰康红豆杉生物工程有限公司提供，经浙江中医药大学张水利教授鉴定为南方红豆杉Taxuschinensisvar.mairei(Lemee et Levl.) Cheng et L.K.Fu的带叶枝条；葡萄糖标准品购自中国食品药品检定研究院；其他试剂均为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 药材处理

本文根据浙江省天气特点和南方红豆杉特性设置了65%RH、75%RH(常湿)和85%RH三个贮藏湿度。在干燥器内放置一大小适宜的盛有适当浓度硫酸的敞口锥形瓶，按控制相对湿度用的硫酸溶液表配置65%RH、75%RH和85%RH三个贮藏湿度，同时内部放一温湿度计，预先准备好的相对湿度控制箱密闭一定时间后，静置稳定，将选好的南方红豆杉带叶枝条置其中堆放，温度控制在20±5 ℃，均不遮光，每隔5 d翻动检查一次。自贮藏开始每隔15 d取样一次，每组平行3份，为期3个月，测定各指标性成分的含量，以新鲜样品(贮藏0d)测得的考察指标为对照。

2.2 多糖含量测定

2.2.1 总多糖提取 取南方红豆杉提取完紫杉醇后的药渣，摊晒过夜后，精密称取样品1.5 g，平行3份，于150 mL三角锥形瓶中，加入30倍量蒸馏水，超声提取30 min，超声功率为80 W，过滤药渣；滤液中加入0.5 g粉末型活性炭脱色，搅拌后静置30 min，滤除炭，定容到50 mL；将滤液进行Sevage法除蛋白(正丁醇∶氯仿=1∶4)，于分液漏斗中反复振摇至溶液分界面交界处无白色混悬(5次)，合并滤液，浓缩并定容到50 mL；从浓缩滤液中精密吸取2.0 mL加入4倍体积的无水乙醇，至乙醇体积分数达到80%，冰箱静置24h后，4000 rpm高速离心5 min，倒去上清液，沉淀部分加3.0 mL蒸馏水溶解，即得[10-11]。

2.2.2 总多糖测定 采用苯酚-硫酸法，精密吸取对照品溶液2.0 mL，置20 mL具塞试管内，加5%苯酚1.0 mL和浓硫酸试剂5.0 mL，加塞，立即摇匀，室温(25 ℃)放置1 min后，置于沸水浴15 min，冰水浴3 min后取出，再室温放置10 min后，用紫外分光光度计测定吸光度。

3 实验结果

3.1 苯酚-硫酸法测定总多糖含量方法的建立

3.1.1 标准品溶液的制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的D-葡萄糖对照品0.249 mg，加蒸馏水溶解并定容至250 mL容量瓶中，摇匀，即得0.996 mg·mL-1葡萄糖标准品溶液，备用。

3.1.2 最佳检测波长的选择 采用苯酚-硫酸法，精密吸取对照品溶液2.0 mL置20 mL具塞试管内，加5%苯酚1.0 mL和浓硫酸试剂5.0 mL，加塞，立即摇匀，室温(25 ℃)放置1 min后，置于沸水浴15 min，冰水浴3 min后取出，再室温放置10 min后，用紫外分光光度计在460～520 nm处扫描，于490 nm有最大吸收(A)，因此，选择490 nm为测定波长。

3.1.3 标准曲线的制作 精密吸取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL对照品溶液置10.0 mL具塞试管内，浓度分别为0.000、0.010 0、0.019 9、0.039 8、0.059 8、0.079 7、0.099 6 mg·mL-1，按“2.2.2”的含量测定方法，在490 nm波长处测定吸光度。以首管为空白对照，以吸光度对浓度作标准曲线得方程为：Y=0.939 3X+0.006 4(r=0.999 5)，其中Y代表吸光度A，X代表浓度。结果表明，葡萄糖在浓度0.010 0～0.099 6 mg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。

3.1.4 稳定性试验 精密吸取供试品液，按“2.2.2”的含量测定方法，在490 nm波长处间隔一定时间测定吸光度，测得RSD=1.27%，结果表明在150 min内呈良好的稳定性。结果见表1。

表1 南方红豆杉总多糖测定方法中稳定性试验

3.1.5 精密度试验 取同一份南方红豆杉的供试品溶液，按“2.2.2”的含量测定方法，在490 nm波长处测定吸光度，重复6次，测得RSD=2.11%，结果表明精密度良好。结果见表2。

3.1.6 重复性试验 取同一南方红豆杉药材6份，按“2.2.1”的总多糖提取方法提取，并按“2.2.2”的含量测定方法，在490 nm波长处测定吸光度，测得RSD=3.86%，结果表明重现性良好。结果见表2。

表2 南方红豆杉总多糖测定方法中精密度试验、重复性试验结果

3.1.7 回收率试验 精密吸取已知含量的南方红豆杉多糖供试品5份，加入一定量葡萄糖标准品溶液，按“2.2.2”的含量测定方法，在490 nm波长处测定吸光度，计算得平均回收率为97.40%，RSD=1.44%。结果见表3。

表3 南方红豆杉多糖回收率试验测定结果

3.2 总多糖含量测定结果

3.2.1 新鲜南方红豆杉总多糖含量测定结果 精密吸取新鲜南方红豆杉供试品溶液2.0 mL，以2.0 mL蒸馏水为空白对照，每管加5%苯酚1.0 mL和浓硫酸试剂5.0 mL，加塞，立即摇匀，室温(25 ℃)放置1 min后，置于沸水浴15 min，冰水浴3 min后取出，再室温放置10 min后，按“2.2.2”的含量测定方法，在490 nm波长处测定吸光度。按照标准曲线求得其含量，结果见表4。

表4 新鲜南方红豆杉多糖的含量 (%)

3.3 不同湿度下总多糖含量测定结果

取不同湿度下南方红豆杉总多糖供试品溶液，按“2.2.2”的含量测定方法，在490 nm波长处测定吸光度，结果见表5，图1。

表5 不同湿度下南方红豆杉总多糖含量测定结果(%)

图1 不同贮藏湿度下南方红豆杉总多糖的含量变化

4 讨论

自然贮藏环境因子通过影响南方红豆杉的主要生理生化进而影响了南方红豆杉表现出的各种特性，如抗逆性和次生代谢物含量变化。自然贮藏环境因子对南方红豆杉各项生理活动的影响错综复杂，多个贮藏环境因子可能作用于同一个代谢过程，而且各个环境因子间也相互作用，呈现出网状关系。本文考察了湿度这主要的影响因素，并从极端环境考察其对南方红豆杉多糖的含量变化随着贮藏时间变化的规律，选择出最佳的湿度贮藏条件，为确定南方红豆杉最佳贮藏环境提供理论依据和有效基础。

由表5，图1看出3种湿度贮藏下的南方红豆杉总多糖的含量变化趋势总体相同，均随着贮藏时间的延长呈先上升后下降的趋势变化。南方红豆杉总多糖的含量是基本上是65%RH>75%RH>85%RH的，且当贮藏湿度为85%RH，贮藏天数为15 d时，南方红豆杉总多糖含量达到最高值5.69%，75%RH贮藏下第45 d含量最高值5.71%，65%RH贮藏下第60 d含量最高值5.98%，随后均下降。在贮藏3个月后，65%RH组降到4.64%，75%RH组降到了4.36%，85%RH组降到了2.21%，其中只有85%RH组比0 d是降低的，其余两组都是升高的。

结果表明南方红豆杉在3个湿度水平贮藏条件下，随着贮藏湿度的升高和时间的延长，总多糖含量先升高后又开始下降的迹象；在65%RH环境下贮藏，相对于75%RH环境下水分被吸收，呼吸作用较弱，多糖含量较高；而随着湿度的增高，85%RH环境下贮藏，相对于75%RH环境下反而吸收水分，呼吸速率较强，放出的热量和水汽增多，多糖含量较低，考虑到可能高湿环境影响霉菌的生长，分解多糖。所以，初步可确定在65%RH环境下更有利于南方红豆杉总多糖含量的保持和累积。此外，本文在提取完紫杉烷类成分后的南方红豆杉药渣中提取多糖，从资源保护的角度使得南方红豆杉药用植物资源能够得到充分的开发应用，为丰富其资源利用的奠定基础。

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DynamicChangeofPolysaccharideContentinSouthChineseYewunderStorageConditionsofDifferentHumidity

CHENFajun1，ZHANGChunchun2，YUYang1，XIONGYaoKang2*

(1.ProductivityPromotionCenterofLishuiMunicipalScienceandTechnologyBureau,Lishui323000,China;2.ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China)

Objective：To determine the content of polysaccharides in the branches of the southern branch of theTaxuschinensisvar.mairei(Lemee et Levl.)Cheng et L.K.Fu under storage conditions of different humidity，and determine the optimum storage humidity environment of the polysaccharide in theT.chinensisvar.mairei.Methods：The content of polysaccharide inT.chinensisvar.maireiwas measured under 65% RH，75% RH and 85% storage condition to select optimal storage condition.Results：The total polysaccharide content ofT.chinensisvar.maireiincreased firstly and then decreased，and the total polysaccharide under different storage condition was as follows：65%RH>75%RH>85%RH in 0-3 months.Conclusion：The best storage environment of the polysaccharide component ofT.chinensisvar.maireiis 65%RH low humidity environment.

Taxuschinensisvar.mairei(Lemee et Levl.)Cheng et L.K.Fu；polysaccharide；humidity

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.6.018

2016-01-20)

国家中医药行业科研专项(201407002)；丽水市科技计划项目(2014JDJS02)；丽水市科技特派员项目(2013tpy02)；中央本级重大增减支项目(2060302)

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熊耀康，教授，研究方向：中药品质评价及资源开发利用；E-mail：xiongyaokang@126.com