大青山油松根际固氮菌的多样性研究

牛艳芳， 王飞宇， 陈立红*， 闫 伟

(1.内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特 010019；2.内蒙古农业大学林学院，内蒙古呼和浩特 010019)



大青山油松根际固氮菌的多样性研究

牛艳芳1,2， 王飞宇1， 陈立红1*， 闫 伟2

(1.内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特 010019；2.内蒙古农业大学林学院，内蒙古呼和浩特 010019)

[目的]研究大青山油松树种根际固氮菌的多样性。[方法]对从大青山油松(Pinustabulaeformis)根际土壤中分离的固氮菌进行16S rDNA扩增及序列测定，应用 DNAMAN 6.0软件进行多序列比对，使用 MEGA4软件构建系统发育树。[结果]大青山油松根际土壤中分离的46株固氮菌分属于Pseudomonas、Bacillus、Phyllobacterium、Cupriavidus、Paenibacillus、Enterobacter、Agrobacterium、Arthrobacter、Naxibacter、Burkholderia、Ensifer等11个不同的类群，其中Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Phyllobacterium为优势属种。系统分析表明，大青山油松根际土壤中固氮菌具有较丰富的多样性。[结论]该研究结果可为森林生态系统的可持续发展提供理论依据。

大青山；油松；固氮菌；16S rDNA

生物固氮是生物圈氮素的重要来源，对于陆地生态系统具有基础性作用[1-3]。森林生态系统作为陆地生态系统的主体，在调节全球碳平衡和减缓全球气候变化进程中扮演着重要角色，具有其他生态系统无可替代的作用[4]。由于近几十年的开发和利用，森林、草地、湿地生态系统均受到了不同程度破坏，造成面积缩小，生态系统失衡。

大青山位于内蒙古呼和浩特市和包头市一线北侧，属于阴山山脉中段，地处110°45′52″～111°32′12″E，40°37′41″～40°57′30″N。该区地处温带半干旱区，属于大陆性气候，海拔1 050～2 374 m。大青山是阴山山脉植物种数最丰富的一段山体，森林覆盖率为41.65%，土壤类型有淋溶灰褐土、粗骨土、山地栗钙土、灰褐土和草灌灰褐土等。森林植被包括针叶林和阔叶林，其中针叶林主要树种有油松、青海云杉、杜松，局部地区出现华北落叶松，阔叶林主要树种有白桦、辽东栎、蒙椴、山杨、山杏[5-6]。内蒙古从东到西有大兴安岭—阴山山脉—贺兰山，这些地区温度、适度、降雨量、蒸发量、土壤类型和植被类型等生态条件复杂多变，而针叶树种落叶松和油松是这些山脉森林地带的主要树种，它们在维持和改善内蒙古生态环境中占据重要地位[7-10]。笔者研究大青山油松树种根际固氮菌的多样性，旨在为森林生态系统的可持续发展提供理论依据。

1　材料与方法

1.1土样采集试验地位于内蒙古大青山古路板林场人工油松林，地处111°50′40″E，40°58′12″N，坡度16°，海拔1 307 m。该区地处内陆北纬中温带，属于典型的大陆性半干旱季风气候。年平均降水量为350 ～ 450 mm，湿度0.3～0.6，年平均气温6 ℃，无霜期120 d。土壤主要为山地栗钙土，质地多为砂壤和轻壤土，pH在7.0 左右。油松人工林的平均基径为9.50 cm，平均树高为549 cm，林龄为21 a[11]。将土壤样品装入无菌的封口袋编号标记，带回后放置于4 ℃冰箱中冷藏。

1.2固氮菌的分离与纯化采用阿须贝培养基(葡萄糖 10 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaSO40.2 g、CaCO35 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2)分离和纯化土壤样品中的固氮菌。称取10 g土样，放入装有90 mL无菌水的加有玻璃珠的三角瓶中，在摇床上150 r/min，振荡20 min,依次制成10-3、10-4、10-53个不同稀释度的土壤悬液，分别接种到培养皿中，用无菌玻璃棒涂布均匀，28 ℃下恒温培养6～7 d。将培养出来的固氮菌菌落采用划线法进行分离，约4～5代后即可分离到纯种的固氮菌。将纯化后的固氮保存在试管中，置于4 ℃冰箱中备用[12-15]。

1.3固氮菌基因组DNA的提取在1.5 mL灭菌的离心管中加入 500 μL TE 溶液，用无菌牙签刮取培养皿上的单菌落溶于TE溶液中。在每个离心管中加入 50 mg/mL 的溶菌酶3 μL，充分混匀，在 37 ℃下作用 2 h。在每个离心管中再加入5 mol/L NaCl 30 μL和 20% 的 SDS 30 μL，充分混匀，在 65 ℃下作用 1 h。加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀，在 12 000 r/min 离心 10 min，此后收集上清液约400 μL于新的灭菌离心管中。加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，12 000 r/min离心 5 min，收集沉淀。用70%的乙醇洗涤沉淀，之后将乙醇倒掉，用无菌滤纸吸干离心管中的水分，风干后再溶于 50 μL 的 ddH2O中，保存于-20 ℃下。

1.4固氮菌16S rDNA的扩增以固氮菌基因组DNA为模板，采用细菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增16S rDNA。PCR反应体系为：12.5 μL DreamTaqGreen PCR Master Mix(2×)、1.0 μL 10 μmol/L引物27f、1 μL 10 μmol/L引物1492 r，1.0 μL模板DNA，添加9.5 μL ddH2O补足至25 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测[16]。

1.5系统发育树的构建PCR产物由上海生工生物工程有限公司进行测序，将测定的16S rDNA序列在GenBank数据库中BLAST同源序列，利用DNAMAN软件进行多序列比对并人工校对，利用MEGA 4.0软件计算Kimura′s two-parameter遗传距离，并构建Neighbor-Joining(NJ)自展一致系统发育树，自展重复总数为1 000[17]。

2　结果与分析

2.116S rDNA的扩增采用阿须贝无氮培养基对采自大青山油松根际土壤中的固氮菌进行分离。根据菌落形态、大小和颜色以及菌体形态和大小等特征，分离出57株固氮菌。以细菌通用引物27f 和1 492r 对分离菌株的16S rDNA 基因片段进行扩增，所得片段大小约为1.5 kb(图1)。

图1　固氮菌16S rDNA PCR扩增产物的电泳图谱Fig.1　The amplified products of 16S rDNA gene from nitrogen-fixing bacteria strains

2.216S rDNA系统发育分析应用 DNAMAN 6.0 软件对分离出的菌株和从GenBank数据库中下载与待分析序列相近的已知种模式菌株的 16S rDNA序列进行多序列比对,然后使用MEGA4.0软件采用邻接法(Neighbor-joining method) 构建部分分离的固氮菌菌株与相关菌株的16S rDNA基因序列的系统发育树。从图2可以看出，呼和浩特大青山油松根际土壤中固氮菌具有非常丰富的多样性，它们分布于11个系统发育分支上。菌株 QS7、QS19、QS30、QS32、QS33、QS36、QS39、QS41、QS50、QS53 等菌株与菌株Pseudomonassp.Ats6 和Pseudomonassp.3-7 聚在一起；菌株 QS25、QS55 和菌株Enterobactersp.D22 聚在一起；菌株 QS14 和菌株Naxibactersp.6981 聚在一起；菌株 QS15 和菌株Burkholderiasp.5AT11 聚在一起；菌株QS1、QS6、QS24、QS261 和菌株Cupriavidusnecatorss1-6-6 聚在一起；菌株QS2、QS54、QS332 和菌株PhyllobacteriumsophoraeCCBAU 03415 聚在一起；菌株 QS3 和菌株Ensifersp.S16 聚在一起；菌株 QS4、QS27 和菌株AgrobacteriumtumefaciensCh3 聚在一起；菌株 QS31 和菌株ArthrobacterS3.TSA.019 聚在一起；菌株 QS12、QS26与菌株Paenibacillussp.C-19-1 聚在一起；菌株 QS23、QS29、QS35、QS37 与菌株Bacillussp.DU190(2010) 聚在同一分支上。

图2　固氮菌基于16S rDNA序列的系统发育树Fig.2　 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences from nitrogen-fixing bacteria strains

2.3大青山油松根际固氮菌群落结构分析利用阿须贝培养基从大青山油松根际土壤中共分离出固氮菌57株，经16S rDNA序列鉴定出46株固氮菌。其中，Pseudomonas有11株，占23.91%；Bacillus有7株，占15.22%；Arthrobacter有7株，占15.22%；Phyllobacterium有5株，占10.87%；Paenibacillus有4株，占8.7%；Cupriavidus有4株，占8.7%；Enterobacter有3株，占6.52%；Agrobacterium、Naxibacter、Burkholderia、Ensifer等4个属的固氮菌5株，占10.87%。在大青山油松根际土壤中Pseudomonas、Bacillus、Phyllobacterium、Arthrobacter为优势属，其数量从多到少依次为：Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Phyllobacterium。

表1　不同固氮菌类群所占比例

3　结论

结合菌体形态学特征和系统发育分析，从大青山油松根际土壤中分离出46株固氮菌，它们分布于11个系统发育分支上。其中，11株属于Pseudomonas，7株属于Bacillus，7株属于Arthrobacter，5株属于Phyllobacterium，其余18株分属于Cupriavidus、Paenibacillus、Enterobacter、Agrobacterium、Naxibacter、Burkholderia、Ensifer等7个不同的属。大青山油松根际土壤中固氮菌具有较丰富的多样性，其中Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Phyllobacterium属于优势类群。

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Diversity of Nitrogen-fixing Bacteria fromPinustabulaeformisin Daqing Mountains

NIU Yan-fang1,2,WANG Fei-yu1,CHEN Li-hong1*et al

(1.Agricultural College,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot,Inner Mongolia 010019; 2.College of Forestry,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot,Inner Mongolia 010019)

[Objective] The aim was to study diversity of nitrogen-fixing bacteria isolated fromPinustabulaeformisin Daqing Mountains.[Method] To amply and sequence 16S rDNA gene of nitrogen-fixing bacteria isolated fromPinustabulaeformisin Daqing Mountains,the alignment of 16S rDNA sequences was conducted by DNAMAN 6.0,and the Neighbor-joining phylogenetic tree was constructed by MEGA 4 software.[Result] The phylogenetic analysis showed that forty-six isolates fromP.tabulaeformisbelonged to eleven groups,which arePseudomonas,Bacillus,Phyllobacterium,Cupriavidus,Paenibacillus,Enterobacter,Agrobacterium,Arthrobacter,Naxibacter,Burkholderia,Ensifer,andPseudomonas,Bacillus,Arthrobacter,Phyllobacteriumare dominant groups.The results showed that the nitrogen-fixing bacteria fromP.tabulaeformisin Daqing Mountains have rich diversity.[Conclusion] The results can provide theoretical basis for sustainable development of forest ecosystem.

Daqing Mountains;Pinustabulaeformis; Nitrogen-fixing bacteria; 16S rDNA

国家自然科学基金项目(31260173) 。

牛艳芳(1977- )，女，内蒙古包头人，博士研究生，研究方向:林木生物技术。*通讯作者，副教授，博士，从事土壤微生物和林木生物技术研究。

2016-06-20

S 718.8

A

0517-6611(2016)22-001-03