黎药除湿祛风汤对鸡Ⅱ型胶原蛋白诱导关节炎模型大鼠的保护作用研究Δ

张　丽，张一云，符　洪，王开裕，雷玲芳，王春桃#

（1.海南省中医院药学部，海口　570203；2.海南省药物研究所，海口　570216）

·民族医药·

黎药除湿祛风汤对鸡Ⅱ型胶原蛋白诱导关节炎模型大鼠的保护作用研究Δ

张丽1＊，张一云2，符洪2，王开裕1，雷玲芳1，王春桃2#

（1.海南省中医院药学部，海口570203；2.海南省药物研究所，海口570216）

目的：研究黎药除湿祛风汤对鸡Ⅱ型胶原蛋白诱导关节炎模型大鼠的保护作用。方法：将60只大鼠随机分为正常组、模型组、阳性组和除湿祛风汤高、中、低剂量组［45.9、22.95、11.48 g（生药）/kg］，除正常组外，其余各组大鼠均以鸡Ⅱ型胶原蛋白诱导关节炎模型。建模后，除湿祛风汤各剂量组大鼠ig相应药物，正常组和模型组大鼠ig生理盐水，每天1次，连续给药12 d；阳性组大鼠实验1～3 d ig来氟米特4.5 mg/kg，4～12 d ig来氟米特1.8 mg/kg，每天1次。观察大鼠关节病变程度并进行评分，测定关节肿胀度和血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和Ⅱ型胶原蛋白抗体水平。结果：与正常组比较，模型组大鼠关节炎指数评分、关节肿胀度及血清中TNF-α、IL-1β、Ⅱ型胶原蛋白抗体水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，阳性组和除湿祛风汤高剂量组大鼠病理评分显著降低，各给药组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、Ⅱ型胶原蛋白抗体水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结论：黎药除湿祛风汤对鸡Ⅱ型胶原蛋白诱导模型大鼠具有一定的保护作用。

黎药；除湿祛风汤；类风湿性关节炎；肿瘤坏死因子α；白细胞介素1β；大鼠

类风湿关节炎（RA）是一种慢性、全身性自身免疫性疾病。该病可能的诱因有身体因素（如劳累、关节损伤、感染等），生活环节潮湿，天气变化以及精神方面的疾病、创伤等［1］，病理机制尚未完全阐明。滑膜间充质细胞、基质金属蛋白酶和破骨细胞是RA患者关节破坏的3种主要细胞［2］。活化的滑膜细胞具有永生性、侵袭性，直接侵蚀关节软骨，释放大量肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）等促炎因子，从而诱发或加速RA的形成［3-4］。

黎族验方湿祛风汤主要由黄连藤、胆木、雅能树、龙骨枫、渴扑、苏木、松筋藤等18种黎族药材组成，该方由五指山海南黎族民间医药研究协会提供。其具有祛风除湿、通络除痹、治疗风湿关节痛的功效［5］。因本方为验方，虽然临床应用疗效显著，但无药效学实验依据。因此，在本研究中，作者拟以鸡Ⅱ型胶原蛋白诱导关节炎（CIA）大鼠模型（此模型的发病机制与人RA的发病机制相似），并以来氟米特片为阳性药物，考察湿祛风汤对RA的药效学作用，为传统黎族经验方提供更科学的依据，为未来黎族药物研发奠定实验基础。

1　材料

1.1仪器

YLS-7C足趾容积测量仪（河南益阳仪器厂）；KHB-ST360酶标仪（上海科华仪器厂）；DT5-2离心机（北京时代北利离心机有限公司）；AUW220D电子天平（日本岛津公司）。

1.2药材、药品与试剂

黄连藤、胆木、雅能树、龙骨枫、渴扑、苏木、松筋藤等18种药材均由五指山海南黎族民间医药研究协会采集、提供，经海南大学黄世满教授鉴定均为真品；来氟米特片（苏州长征-欣凯制药有限公司，批号：13070310，规格：10 mg/片；鸡Ⅱ型胶原蛋白（美国Sigma公司）；IL-1β、Ⅱ型胶原蛋白抗体、TNF-α酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（美国TSZ公司）；水为生理盐水，其余试剂均为分析纯。

1.3动物

健康SD大鼠60只，♀，体质量（200±50）g，购自广东省医学实验动物中心［生产许可证号：SCXK（粤）2013-0002］。

2　方法

2.1除湿祛风汤的制备

按方中组成称取相应药材，共计255 g。加5倍量水煎煮30 min，过滤，收集滤液；滤渣再加5倍量水煎煮30 min；合并2次滤液，浓缩至药液体积为110 ml，即得。

2.2动物造模、分组与给药

2.2.1造模取50只大鼠于背部sc鸡Ⅱ型胶原蛋白（0.5 mg/ml），每只0.9～1.0 ml，分5～8点注射，复制CIA型关节炎模型。致炎后7 d，再ip相同剂量药物并通过左足底sc鸡Ⅱ型胶原蛋白（0.1 ml/只），以加强免疫攻击（此时大鼠可见明显过敏反应，如腹部收缩、背部拱起、左足立即变红）。致炎18 d后，大鼠左足明显红肿，提示造模成功。

2.2.2分组造模后将造模大鼠随机分为模型组、阳性组和除湿祛风汤高、中、低剂量组，每组10只；另取10只正常大鼠作为正常组。

2.2.3给药除湿祛风汤高、中、低剂量组大鼠分别ig除湿祛风汤45.9、22.95、11.48 g/kg（给药量按生药计，按体表面积换算，分别为人临床用量的10、5、2.5倍），每天1次，连续12 d；阳性组大鼠在实验前3 d按4.5×10-3g/kg（按人体剂量给予负荷剂量50 mg算）ig来氟米特片溶液，实验第4～12 d按1.8×10-3g/kg（按人体剂量给予维持剂量每次20 mg）ig来氟米特片溶液，每天1次，连续12 d；正常组和模型组大鼠按1 ml/100 g ig生理盐水，每天1次，连续12 d。

2.3指标考察

2.3.1关节炎指数评分给药当日（1 d）开始，观察各组大鼠后肢关节病变程度。采用关节炎指数积分法，参考文献［6］对病变进行评分：0分代表关节无红肿；1分代表关节有红色斑点或轻度肿胀；2分代表关节中度肿胀；3分代表关节严重肿胀；4分代表关节严重肿胀且不能负重；5分代表关节肿胀且变形。关节炎指数评分越高，表示关节炎症状越严重。记录给药第1天（1 d）、给药第6天（6 d）及第12天（12 d）各组大鼠后肢关节病理评分，最后评分为大鼠左、右后足的病理评分之和。

2.3.2足肿胀度末次给药1 h后，用10%戊巴比妥钠（2 ml/只）将大鼠深度麻醉，称体质量（g），用足肿胀度仪测量各组大鼠后足踝关节以下的容积（ml），计算肿胀度［肿胀度=足容积（ml）/体质量（100 g）］。

2.3.3生化指标在麻醉后大鼠的下腔静脉取血，使用一次性人体静脉血样采集容器收集血液，分离血清，-20℃保存，备用。ELISA法测定血清中抗Ⅱ型胶原蛋白抗体、TNF-α和IL-1β水平，具体操作按相应试剂盒说明书进行。计算药物对炎性因子及抗体的抑制率［抑制率=（模型组指标水平-给药组指标水平）/（模型组指标水平-正常组指标水平）×100%］。

2.4统计学方法

3　结果

3.1各组大鼠关节炎指数评分结果

给药1 d时，与模型组比较，各给药组大鼠关节炎指数评分几乎一致，差异均无统计学意义（P＞0.05）。给药6 d时，模型组大鼠关节炎指数评分升高，其余各组大鼠关节炎指数评分较模型组均有一定抑制，但各组间差无统计学意义（P＞0.05）。给药12 d时，模型组大鼠关节炎指数评分继续升高，其余各组大鼠关节炎指数评分较模型组均有所降低，其中阳性组和除湿祛风汤高剂量组差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。各组大鼠关节炎指数评分结果见表1。

表1　各组大鼠关节炎指数评分结果（±s，n=10）Tab 1　Arthritis index of joint in rats of each group（±s，n=10）

表1　各组大鼠关节炎指数评分结果（±s，n=10）Tab 1　Arthritis index of joint in rats of each group（±s，n=10）

注：与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

给药12 d 4.2±0.84 2.6±0.55＊＊2.8±0.45＊3.0±0.71 3.2±0.84组别模型组阳性组除湿祛风汤高剂量组除湿祛风汤中剂量组除湿祛风汤低剂量组剂量，g/kg 关节炎指数评分4.5×10-3或1.8×10-345.9 22.95 11.48给药1 d 3.4±0.55 3.2±0.45 3.4±0.55 3.4±0.55 3.4±1.14给药6 d 3.8±0.45 3.0±0.71 3.2±0.84 3.4±0.55 3.4±1.14

3.2各组大鼠足肿胀度测定结果

正常组大鼠左、右后足肿胀度一致，属于正常状态。与正常组比较，模型组大鼠左、右后足肿胀度升高（P＜0.01）。与模型组比较，阳性组和除湿祛风汤高剂量组大鼠左后足肿胀度降低（P＜0.05或P＜0.01），右后足肿胀度差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠足肿胀度测定结果见表2。

表2　各组大鼠足肿胀度测定结果（±s，n=10，ml/100g）Tab 2　Degree of foot swelling in rats of each group（±s，n=10，ml/100g）

表2　各组大鼠足肿胀度测定结果（±s，n=10，ml/100g）Tab 2　Degree of foot swelling in rats of each group（±s，n=10，ml/100g）

注：与正常组比较，＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

右后足0.57±0.07 0.83±0.07＊0.72±0.09 0.74±0.09 0.77±0.10 0.76±0.11组别正常组模型组阳性组除湿祛风汤高剂量组除湿祛风汤中剂量组除湿祛风汤低剂量组剂量，g/kg 4.5×10-3或1.8×10-345.9 22.95 11.48左后足0.58±0.07 1.26±0.18＊0.88±0.14##1.00±0.14#1.02±0.15 1.11±0.16

3.3各组大鼠血清中炎症因子测定结果

与正常组比较，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，阳性组和除湿祛风汤高、中剂量大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；除湿祛风汤低剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平测定结果见表3。

3.4各组大鼠血清中Ⅱ型胶原蛋白抗体含量测定结果

正常组比较，模型组大鼠血清中Ⅱ型胶原蛋白抗体含量显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，阳性组和除湿祛风汤高、中剂量组大鼠血清中Ⅱ型胶原蛋白抗体含量显著减少（P＜0.05或P＜0.01）；除湿祛风汤低剂量组大鼠血清中Ⅱ型胶原蛋白抗体含量差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠血清中Ⅱ型胶原蛋白抗体含量测定结果见表4。

表3　各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平测定结果（±s，n= 10）Tab 3　Serum levels of TNF-α and IL-1β in rats of each group（±s，n=10）

表3　各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平测定结果（±s，n= 10）Tab 3　Serum levels of TNF-α and IL-1β in rats of each group（±s，n=10）

注：与正常组比较，＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

78.5 74.3 71.7 42.5组别正常组模型组阳性组除湿祛风汤高剂量组除湿祛风汤中剂量组除湿祛风汤低剂量组TNF-α含量，pg/ml 37.42±4.75 72.42±2.56＊48.39±10.07#47.18±3.75##57.74±13.84 58.39±12.35抑制率，%抑制率，% 0 0 68.7 72.1 41.9 40.1 IL-1β含量，pg/ml 8.24±0.37 11.63±1.05＊8.97±0.68##9.11±0.33##9.20±0.78##10.19±0.89

表4　各组大鼠血清中Ⅱ型胶原蛋白抗体含量测定结果（±s，n=10）Tab 4　Serum content of typeⅡcollagen antibody in rats of each group（±s，n=10）

表4　各组大鼠血清中Ⅱ型胶原蛋白抗体含量测定结果（±s，n=10）Tab 4　Serum content of typeⅡcollagen antibody in rats of each group（±s，n=10）

注：与正常组比较，＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01 Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

61.0 49.0 44.8 0组别正常组模型组阳性组除湿祛风汤高剂量组除湿祛风汤中剂量组除湿祛风汤低剂量组剂量，g/kg 抑制率，% 4.5×10-3或1.8×10-345.9 22.95 11.48Ⅱ型胶原蛋白抗体，pg/ml 8.37±0.73 12.96±1.33＊10.16±0.69##10.71±0.86#10.90±0.58 13.06±2.96

4　讨论

目前，常用的关节炎动物模型主要有Ⅱ型胶原蛋白诱导的关节炎模型（CIA型）和完全弗氏佐剂诱导的佐剂性关节炎动物模型（AA型）两种。CIA模型［2］在病理学的诱因及变化上与人RA更为相似，更适合作为关节炎模型［3］，故在本实验中笔者用此模型进行RA的研究。造模后，可见成模大鼠关节严重红肿、变形，无法正常利用关节站立，提示造模成功。在此模型中，Ⅱ型胶原蛋白诱导产生的免疫失衡是导致软骨损伤的诱因，因此大鼠体内的Ⅱ型胶原蛋白抗体含量与RA症状呈正相关。本实验结果显示，模型组大鼠血清中Ⅱ型胶原蛋白抗体含量显著增加，表明造模成功；除湿祛风汤高、中剂量组大鼠血清中Ⅱ型胶原蛋白抗体含量显著减少，表明用药后关节炎症状得到改善；然而除湿祛风汤低剂量组大鼠血清中Ⅱ型胶原蛋白抗体水平与模型组接近，表明此剂量下无治疗作用。

来氟米特片作为一种免疫调节剂，是当前应用于类风湿性关节炎较广泛的药物，具有疗效好、起效快、不良反应较轻的优点［7］。其机制为抑制嘧啶合成途径，从而抑制淋巴细胞活化增殖能力［8］，降低免疫球蛋白、炎性因子释放等，因此笔者在本实验中以其为阳性对照药。

TNF-α是一种促炎因子，主要通过巨噬细胞表达，具有刺激免疫细胞转化、诱发新生血管生成的作用，其与软骨结构的破坏相关［3］。因此，市面上开发出了一系列针对TNF-α的单抗抑制剂［9］，旨在通过抗体结合从而降低血清中TNF-α水平，缓解关节炎性反应，然而却存在潜在的感染及肿瘤风险［10］。而针对IL-1的抑制剂主要通过拮抗作用降低IL-1水平，IL-1Ra是IL-1的受体拮抗剂［11］，注射外源IL-1Ra便能明显减轻关节软骨破坏。在本实验中发现黎药处方能显著地抑制TNF-α、IL-1β水平，表明该方具有较强的调节体内免疫功能，可能通过恢复体内各免疫系统之间拮抗作用而发挥作用，尤其针对IL-1β的作用非常明显，达到阈值的给药剂量（在低剂量与中剂量之间）便能非常显著地抑制IL-1β产生，能够直接保护关节软骨及抑制后续炎症的发展。从对TNF-α及IL-1β的作用效果来看，本黎药处方中剂量在降低关节炎损害的同时，又无过多增加感染及肿瘤的风险，是一种风险较低的RA药物。

关节滑膜、软骨及骨损伤是关节炎3个不同程度的损伤等级，Ⅱ型胶原蛋白作为软骨标志物，其中有许多抗原表位能够诱发产生抗体，活化的B淋巴细胞产生的Ⅱ型胶原蛋白抗体是软骨破坏的一个重要因素［12］，其可被IL-1系列所刺激活化。在实验中，模型组血清内的Ⅱ型胶原蛋白抗体含量明显升高，而黎药的高、中剂量均能明显地抑制大鼠血清中Ⅱ型胶原蛋白抗体含量，与来氟米特片除湿祛风汤的药效作用在同一水平。这表明该方通过抑制IL-1β的产生能很好地减少Ⅱ型胶原蛋白的体内含量，有助于维持关节软骨组织的稳定。

综上，虽目前尚不得知本黎药处方是否具有恢复骨关节、软骨及滑膜组织再生的作用，需要更进一步研究确定，但本研究可证实此黎药处方是一种优良的、能够明确抑制RA发展的民族药方。

［1］郑希龙，甘炳春，孙伟，等.“材”类黎药资源的传统利用［J］.世界科学技术：中医药现代化，2004，16（2）：313.

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［3］潘磊，杜文喜，卢建华.胶原诱导性和佐剂性大鼠关节炎模型的比较［J］.山西中医学院学报，2013，14（4）：12.

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（编辑：林静）

Study on Protective Effects of Li Medicine Chushi Qufeng Decoction on Arthritis Model Rats Induced by Chicken TypeⅡCollagen

ZHANG Li1，ZHANG Yiyun2，FU Hong2，WANG Kaiyu1，LEI Lingfang1，WANG Chuntao2
（1.Dept.of Pharmacy，Hainan Provincial Hospital of TCM，Haikou 570203，China；2.Pharmaceutical Institute of Hainan Province，Haikou 570216，China）

OBJECTIVE：To study the protective effects of Li medicine Chushi qufeng decoction on arthritis model rats.METHODS：60 rats were randomly divided into normal group，model group，positive group and Chushi qufeng decoction high-dose，medium-dose and low-dose groups［45.9，22.95，11.48 g（crude drug）/kg］.Except for normal group，those groups were given chicken typeⅡ collagen to induce arthritis model.After modeling，normal group and model group were given normal saline intragastrically，once a day，for consecutive 12 d；Chushi qufeng decoction groups were given relevant medicine intragastrically；positive group was given leflunomide 4.5 mg/kg on 1st-3rd day and 1.8 mg/kg on 4th-12th day.The degree of joint lesion in rats were scored.The degree of joint swelling was determined as well as the serum levels of TNF-α，IL-1β and typeⅡ collagen antibody.RESULTS：Compared with normal group，arthritis index，degree of joint swelling，the serum levels of TNF-α，IL-1β and typeⅡcollagen antibody increased significantly in model group（P＜0.01）.Compared with model group，pathological score of positive group and Chushi qufeng decoction high-dose group decreased significantly，and serum levels of TNF-α，IL-1β and typeⅡcollagen antibody decreased significantly in treatment groups（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Li medicine Chushi qufeng decoction has certain protective effect on arthritis model rats induced by chicken typeⅡcollagen.

Li medicine；Chushi qufeng decoction；Rheumatoid arthritis；TNF-α；IL-1β；Rat

R943

A

1001-0408（2016）22-3088-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.19

海南省中药现代化专项项目（No.2015ZY18）

＊副主任中药师。研究方向：医院药学、中药制剂。电话：0898-66224599。E-mail：1047559396@qq.com

副主任药师。研究方向：药品检验、药品质量标准。电话：0898-66832918。E-mail：1721170395@qq.com

2016-03-04

2016-05-16）