结直肠癌微卫星不稳定状态与MTHFR基因多态性及临床病理特征的相关性

井昶雯，　曹海霞，　王　卓，　马　蓉，　吴建中



论著

结直肠癌微卫星不稳定状态与MTHFR基因多态性及临床病理特征的相关性

井昶雯，曹海霞，王卓，马蓉，吴建中

目的检测结直肠癌标本中微卫星稳定性及亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性，并探讨两者的相关性。方法用限制酶内切法检测52例结直肠癌标本的MTHFR基因的多态性，应用毛细管电泳法检测微卫星稳定与否,统计MTHFR多态性、微卫星稳定性与临床病理特征的关系及两者的相关性。结果微卫星不稳定的结直肠癌共14例(26.92%)，与结直肠癌患者年龄(χ2=0.051，P>0.05)、性别(χ2=0.083，P>0.05)和肿瘤分期(χ2=0.259，P>0.05)无相关性，而与肿瘤分化程度(χ2=6.361，P<0.05)和远处转移与否(χ2=4.798，P<0.05)相关。MTHFR CC型29例，CT+TT型23例，两组间结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤分期和有无远处转移差异均无统计学意义(P>0.05)。MTHFR C677T多态与微卫星不稳定性呈正相关性。结论MTHFR C677T多态与结直肠癌微卫星不稳定性有统计学相关性，但具体机制尚需要进一步研究。

结直肠癌；MTHFR；微卫星稳定性；基因多态性

随着饮食结构的改变，结直肠癌在中国的发病率已居肿瘤类第三位，2014年新发病例31万人、死亡15万人，5年生存率为47.2%。微卫星(microsatellite)是具有高度的个体特异性和稳定遗传性的由同一脱氧寡核苷酸重复串联而成的序列，长度一般小于350 bp，重复顺序为1～6 bp。主要分为微卫星稳定(microsatellite stability，MSS)和微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)[1]。NCCN指南(2012 V1)建议Ⅱ期结肠癌进行氟尿嘧啶类单药辅助治疗前应进行MMR或MSI检测。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢系统中的关键酶。677C→T是MTHFR最常见的突变，在第4外显子677位点上的胞嘧啶C突变成为一个胸腺嘧啶T，缬氨酸突变为丙氨酸，主要引起酶活性和热稳定性的改变，有可能影响5-氟尿嘧啶的化疗疗效[2]。本研究对52例结直肠癌标本进行微卫星稳定性及MTHFR基因多态检测，比较二者检出率差异及相关性，为临床结直肠癌患者施行个体化治疗提供理论基础。

1　资料和方法

1.1标本来源

52例临床病理资料完整的结直肠癌标本来自江苏省肿瘤医院，于2012年1月10日至2013年12月15日期间在手术时采集。收取的标本迅速置液氮罐内保存，然后转至-80 ℃超低温冰箱冻存备用。标本均有对应的癌旁组织(距癌组织5 cm以外的肺组织)，且经病理学确诊。

1.2试剂及引物

主要试剂：QIAamp DNA FFPE Tissue Kit和QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN公司)、Taq HS酶(TaKaRa公司)、限制性内切酶(NEB公司)、LIZ和HiDi(甲酰胺)均购置于ABI公司。

我们查阅相关文献报道，由TaKaRa公司合成微卫星的PCR引物[3]，上游引物均以6-FAM标记。具体序列见表1。

表1　微卫星5个片段引物表

1.3检测方法

1.3.1毛细管电泳法检测MSI根据QIAamp DNA FFPE Tissue Kit操作手册提取DNA：分别以肿瘤组织和癌旁组织DNA为模板，按表1中引物进行PCR扩增，D2S123和D17S250由于片段大小相差较大，放置同一PCR管中反应。体系：Taq HS mix 10μl，上下游引物(1 μmol/L)各1 μl，DNA模板100 ng，余用水补足至20 μl。反应条件：95 ℃预变性15 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；60 ℃ 60 min；4 ℃冷却。PCR产物纯化：根据AxyPrepTMPCR Cleanup kit操作说明书进行。取1 μl PCR纯化产物与0.3 μl LIZ和9 μl HiDi混合，95 ℃变性5 min，将变性产物在ABI 3500测序仪上进行毛细管电泳。GeneMapper V4.1对结果进行片段分析。

结果判读：肿瘤组织与癌旁组织比较，5个片段均一致，为MSS；有1个片段缺失、延长或缩短，判为MSI-L(microsatellite instability-high)；有2个及以上为MSI-H(microsatellite instability-high)，具体图形见图1。

1.3.2MTHFR基因多态检测按本实验室前期研究方法[4]对MTHFR基因多态进行检测，步骤如下：

PCR扩增：PCR引物序列 F：5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’；R：5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’。

PCR体系：100 ng DNA，Taq HS mix 10 μl,引物(100 μmol/L)各1 μl，补足体系至20 μl。

PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 60 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，共30个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR产物为246 bp。PCR扩增产物加入HinfI限制性内切酶反应后于3%琼脂糖凝胶中电泳。

结果分析：MTHFR C677T 3种基因型分别是：C/C(198 bp)；C/T(198 bp/175 bp)；T/T(175 bp)。

1.4统计学方法

使用SPSS11.0统计分析软件，用χ2 检验进行统计分析，以双侧检验水准P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1微卫星稳定性与临床病理特征的关系

我们对52例结直肠癌中微卫星稳定状态和临床病理特征的关系进行了统计分析。微卫星稳定的例数有38例(73.08%)，MSI阳性(包括MSI-H和MSI-L)14例 (26.92%)，如表2所示。年龄>60岁的患者有34例，其中MSI阳性 10例(29.41%)；男性患者28例中MSI阳性 8例(28.57%)；肿瘤中高分化33例中MSI阳性 5例(15.15%)；Ⅰ～Ⅱ期患者23例，MSI阳性 7例(30.43%)；无远处转移者22例，MSI阳性9例(40.91%)。据统计学分析，MSI阳性与结直肠癌患者年龄和肿瘤分期无相关性(均P>0.05)，而与肿瘤分化程度和远处转移与否相关(P<0.05)。

注：横坐标为片段大小，纵坐标显示相对荧光强度。A显示某患者诊断为MSI-L，图上箭头所指为肿瘤组织BAT 25位点相较癌旁组织出现双峰；B、C显示另一患者诊断为MSI-H，图上箭头所指为肿瘤组织BAT 25、BAT 26两个位点出现异常主峰。图1　毛细管电泳法检测MSI结果图

表2　微卫星稳定性与结直肠癌病理特征的关系

2.2MTHFR C677T 三种基因型与临床病理特征的关系

如表3所示，MTHFR CC基因型患者中，年龄>60岁的有17例；男性16例；肿瘤中高分化者18例；Ⅰ～Ⅱ期患者10例；无远处转移者10例。而MTHFR CT+TT基因型组中，年龄>60岁的有17例；男性12例；肿瘤中高分化者有15例；Ⅰ～Ⅱ期患者13例；无远处转移者12例。MTHFR CC型和CT+TT型两组间，结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤分期和有无远处转移差异均无统计学意义(P<0.05)。

表3　MTHFR C677T基因型与结直肠癌病理特征的关系

2.3MTHFR C677T基因型与微卫星稳定性的相关性

MTHFR 677 CC基因型结直肠患者中MSI+例数为4例，而MSS例数为25例，CT+TT基因型组MSI+例数为10例，MSS有13例，CC基因型组MSI+比例(13.79%)远远低于CT+TT基因型组(43.48%)，通过校正χ2检验公式，χ2=4.335，P<0.05，说明MTHFR C677T多态与MSI+有正相关性。

3　讨论

MSI是由于错配修复蛋白缺失(MMR)，DNA复制修复异常产生碱基错配，包括高不稳定和低不稳定。微卫星不稳定性的结直肠癌具有特殊的临床病理参数，微卫星不稳定的肿瘤分化程度低，浸润组织更深，较少有淋巴结转移，预后较好与氟尿嘧啶等化疗敏感性相关[5]。因此，微卫星不稳定性检测对于判断结直肠癌的预后及治疗意义重大。在散发性结直肠癌中，MSI的发生率为10%～20%，MSI-H的结直肠癌细胞增殖活性低，肿瘤分化程度低，预后较好，对辅助化疗药物如氟尿嘧啶等不敏感[6]。在此次研究中，52例结直肠癌患者中，MSI阳性率为26.92%，稍高于文献报道的15%～20%，可能与检测人数和检测方法不同有关。有些文献检测的是一两个位点的稳定性，我们通过ABI 3500测序仪进行片段分析检测了5个位点的稳定性，更加敏感。另此次研究结果显示，微卫星不稳定性与肿瘤分化程度和远处转移与否存在统计学的相关性。这与GAFA等[7]的研究结果一致。

MTHFR基因位于染色体1p36.3，编码蛋白的分子量为74.6 kDa。MTHFR作为叶酸代谢过程中的关键酶，催化5，10-亚甲基四氢叶酸产生5-甲基四氢叶酸的还原反应，产物5-甲基四氢叶酸作为叶酸甲基化的甲基供体，使同型半胱氨酸生成蛋氨酸，MTHFR为DNA、RNA和蛋白质的甲基化提供甲基，参与嘌呤和胸腺嘧啶的生物合成，影响正常的DNA代谢。MTHFR C677T多态性将导致MTHFR活性下降，影响DNA甲基化水平，阻碍DNA合成和修复过程[8]。而MTHFR基因突变能增加5-氟尿嘧啶的细胞毒性，提高敏感性，在多种肿瘤如结直肠癌、胃癌中，MTHFR基因多态可预示5-氟尿嘧啶的敏感性[9]。我们此次研究显示，MTHFR CC型和CT+TT型两组间，结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤分期和有无远处转移均无统计学差异。

恶性肿瘤的发生与癌基因、抑癌基因以及错配修复基因等基因的突变及甲基化水平有关。而MSI是由于错配修复蛋白缺失，DNA复制修复异常而产生，因此，我们推测MTHFR C677T多态性导致甲基化异常可能与微卫星不稳定性相关。已有研究报道了直肠癌中MTHFR多态性与MSI的关系，但并没有统一的结论。有研究发现MTHFR 677T多态性增加了MSI阳性结直肠癌的发病风险[10]。而CLARIZIA等[11]认为MTHFR C677T多态位点与微卫星不稳定性并无相关性。本研究发现，MSI阳性结直肠癌组MTHFR 677 CT+TT基因型的频率显著高于MSS结直肠癌组，提示MTHFR 677 CT+TT基因型与MSI密切相关。我们认为，MTHFR基因多态性可能通过调节DNA合成和甲基化影响了错配修复基因的表达，从而导致了微卫星的不稳定性。但此次研究中我们并未涉及到错配修复基因的检测，两者的关系还有机制需要下一步深入研究。

总而言之，我们研究了微卫星不稳定性和MTHFR C677T多态性与结直肠癌临床病理特征的关系，发现结直肠患者中MTHFR C677T多态性与微卫星不稳定性相关，接下来我们还需要收集相关临床资料，进行随访分析，进一步研究两者与5-氟尿嘧啶的敏感性的关系。

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The relationship of microsatellite instability state with MTHFR polymorphism and clinical pathological characteristics in colorectal cancers

JINGChangwen1,CAOHaixia2，WANGZhuo1,MARong1,WUJianzhong1.

(1.ClinicalCancerResearchCenter，JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China； 2.EpidemiologicalResearchLaboratory，JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China)

Crrespondingauthor:WUJianzhong,E-mail:wujzh1528@126.com

ObjectiveThe aim of the study is to investigate the MTHFR gene polymorphism and microsatellite instability in the colorectal cancer, find the relationship between the MTHFR gene polymorphism and microsatellite instability. MethodsFluorescence-labelled primers PCR were applied to detect the microsatellite instability in 52 colorectal cancer patients. MTHFR C677T genotypes were detected by PCR-RFLP method.ResultsMicrosatellite instability positive cases were 14 and MSI was related to tumor differentiation degree and distant metastasis,but no significant correlation with sex,gender and clinical stage.MTHFR 667 site gene polymorphism distribution has no significant correlation with sex，gender，tumor differentiation degree, clinical stage, and distant metastasis but with microsatellite instability state.ConclusionThere is a relationship between the MTHFR gene polymorphism and microsatellite instability. Further study is needed to explore the mechanism.

Colorectal cancer；MTHFR；Microsatellite instability；Gene polymorphism

江苏省卫生厅面上科研项目(H201410)； 江苏省肿瘤防治研究所院内基金(ZM201106和 ZQ201205)

210004江苏南京，江苏省肿瘤医院临床肿瘤实验中心(井昶雯，王卓，马蓉，吴建中)； 江苏省肿瘤医院流行病研究室(曹海霞)

井昶雯，女，助理研究员，主要从事肿瘤分子生物学的基础研究工作,E-mail:jcw223200@163.com

共同第一作者： 曹海霞，女，副研究员，研究方向：肿瘤的流行病学，E-mail:pascallschx@126.com

吴建中，男，研究员，主要从事肿瘤分子生物的基础研究工作，E-mail:wujzh1528@126.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.03.009

1674-4136(2016)03-0177-05

2015-12-28][本文编辑：钦嫣]