转iaaM高衣分棉花种质IF1-1杂种优势分析及育种应用

刘存敬，江振兴，张建宏，唐丽媛，张素君，田海燕，李兴河，师树新，崔瑞敏，张香云*

（1.河北省农林科学院棉花研究所，农业部黄淮海半干旱区棉花生物学与遗传育种重点实验室，河北　石家庄　050051；2.河北行政学院，河北　石家庄　050031）

转iaaM高衣分棉花种质IF1-1杂种优势分析及育种应用

刘存敬1，江振兴2，张建宏1，唐丽媛1，张素君1，田海燕1，李兴河1，师树新1，崔瑞敏1，张香云1*

（1.河北省农林科学院棉花研究所，农业部黄淮海半干旱区棉花生物学与遗传育种重点实验室，河北石家庄050051；2.河北行政学院，河北石家庄050031）

转iaaM（色氨酸单加氧酶基因）高衣分棉花种质已经培育出来，但应用于育种研究较少。我们利用转iaaM高衣分棉花种质IF1-1做父本、16个陆地棉品种（系）做母本，分别配制杂交组合，检测了亲本及其F1和F2群体的iaaM遗传；田间调查了材料的抗病性及农艺性状，室内考查了产量构成因子，同时进行了产量统计分析；通过系统选育结合分子辅助选择对杂交后代进行定向培育，获得了新的高衣分种质，实现了该种质的育种应用。结果表明：（1）FBP7-iaaM是1对显性基因；（2）与高衣分亲本IF1-1相比，F1和F2代衣分不具备超中与超亲优势，但与16个母本品种（系）相比，却能明显提高现有品种（系）的衣分率；（3）F1代产量尤其是皮棉产量具备较明显的超亲优势，皮棉产量优势值为13.4%，这就意味着可以选择生产上产量较高的品种与IF1-1配制杂交组合，选择高优势杂交种直接利用；（4）F1和F2代抗病性明显好于IF1-1，但与母本相比较差，所以，在杂交后代的选择中应注意观察枯萎病和黄萎病的发病情况，选择抗病性好的后代；（5）子棉产量的提高主要是通过铃重和单株铃数的增加来实现，皮棉产量的增加则是通过子棉产量与衣分的共同提高来完成；（6）杂交后代具备选择出高衣分新品系的潜力。本研究实现了将国家科技重大专项获得的第2代转基因棉花种质应用于棉花育种，对提升我国生物育种水平具有重大意义。

IaaM（色氨酸单加氧酶）基因；IF-1种质系；杂种优势；育种应用

我国是棉纺织品消费和出口大国，棉花生产在我国国民经济中占有重要地位。利用传统的育种方法曾在棉花品种改良上取得了很大成功，但是近20 a来，世界棉花品种的产量水平达到了一个平台期。因此有人认为，利用现有的遗传资源和育种手段难以再大幅度提高棉花产量［1］。生长素（auxin）是最早被发现的植物激素，其参与植物生长和发育的许多过程，如根和茎的发育与生长、器官衰老、维管束组织的形成与分化发育、顶端优势以及植物的向性生长等。吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）是英国科学家Darwin父子在金丝雀虉草胚芽鞘向光性试验中首先发现的生长素，现已证实其存在于高等植物以及细菌、真菌和藻类中。植物体内的生长素类物质以IAA为主，还有苯乙酸、吲哚丁酸和4-氯吲哚乙酸等。IaaM（色氨酸单加氧酶基因）是细菌中IAA合成途径之一——吲哚乙酰胺途径的关键酶基因，利用其转化植物的基因工程研究和应用在国外已经开展多年，在国内也有少量报道［2］。植物激素对植物的生长、发育、分化和衰老过程均起着重要的调节作用，因此，对棉纤维细胞的分化和发育也不例外。关于激素对棉纤维发育的研究表明，IAA和赤霉素（GA3）对棉纤维的分化起着重要作用［3～9］，在棉纤维发育过程中IAA和GA3诱导纤维的发生与伸长［8，9］。西南大学将iaaM导入到棉花品种冀棉14中，育成了转基因棉花新种质IF1-1［10］。该种质是通过对棉花内源生长素进行适量上调而显著增加单位面积种皮的纤维细胞凸起数目来实现明显提高其衣分并且降低纤维细度的目的，已被列为棉花第2代转基因新种质材料。2012年3月河北省农林科学院棉花研究所从西南大学引进转基因棉花种质新材料IF1-1，用于育种材料的创制和品种选育。

本研究旨为比较完整地鉴定IF1-1新材料在河北省种植时的产量、抗病性、纤维品质及其他重要性状；获得iaaM在棉花世代中的传递规律；直接利用该种质配制杂交组合的杂种优势分析；筛选杂种后续世代，获得新的转基因高衣分种质。

1　材料与方法

1.1试验材料

选取17个不同类型的亲本用于配制杂交组合，其中，父本为转iaaM高衣分棉花种质新材料IF1-1（表1），由西南大学生物技术中心裴炎教授提供；母本有16个品种（系），分属4个类型，分别是抗病材料1467系、4077系和优选3，优质材料N71、1498系和04N4，适机采材料N327、8120系和08-4系，高产材料2011SA4、冀丰919、创优棉9号、冀棉958、NJ5、2011QCA3号和中植棉2号，均由河北省农林科学院棉花研究所分子设计育种研究室提供。试验材料为父本、16个母本及其配制的16个杂交组合的F1和F2植株，以及其后连续自交得到的杂交F3、F4和F5代。

1.2试验方法

2012年河北省农林科学院棉花研究所自西南大学引进转FBP7-iaaM基因高衣分棉花新种质IF1-1，以其为父本，以16个不同类型（高产、优质、抗病、适机采）的转基因抗虫棉花品种（系）为母本，在河北省农林科学院棉花研究所小安舍实验站配制杂交组合16个；同年冬，将亲本及F1代进行南繁。2013年在河北省农林科学院棉花研究所小安舍试验站进行田间种植，其中，亲本及F1代种植2行/区，F2代群体种植8行/区，不设重复，行距0.8 m，行长8.3 m，株距0.28 m，密度4.5万株/hm2。

采用石磊岩等［11］的5级制，在6月20日枯萎病发病高峰期和8月20日黄萎病发病高峰期进行病株分级调查，计算亲本、F1代、F2代的枯萎病和黄萎病病指（%），以病指数值确定品种的抗病类型。9月10日，调查棉花的株高、果枝节位、果枝数、单株铃数等农艺性状。收获期，小区实收计产（kg/hm2），室内考察单铃重（g）和衣分（%）等。根据公式，计算超中优势和超亲优势：

表1　转FBP7-iaaM高衣分材料IF1-1的外源基因Table 1　The exogenous gene of FBP-iaaM transgenic cotton line IF1-1 with high lint percentage

超中优势（%）=（F-MP）/MP×100〔其中，MP=（P1+P2）/2〕

超亲优势（%）=（F-HP）/HP×100

式中，F、P1、P2分别为杂种、母本和父本性状的平均值，MP为2个亲本性状的平均值，HP为高值亲本性状的平均值。

采用组织化学鉴定法，鉴定亲本以及F1和F2代中的目的基因。参照Jefferson［12］的方法，配置GUS染色液。取幼苗真叶，放入96孔PCR板并置于冰上，加入GUS染色液25 μL/孔，37℃温育4～6 h，统计出现蓝色反应（GUS阳性）和无显色反应（GUS阴性）的幼苗株数。

2014～2015年在河北省农林科学院棉花研究所小安舍试验站种植F3和F4代材料进行田间鉴定，2行/区，不设重复，行距0.8 m，行长8.3 m，株距0.28 m，密度4.5万株/hm2。采用组织化学鉴定法，鉴定参试材料中的目的基因。

利用Excel和SPSS 19.0软件，进行数据的统计与分析。

2　结果与分析

2.1亲本及杂交后代的田间表现

田间调查结果（表2和3）显示，父本（IF1-1）生育期121 d左右；植株塔型，较矮；叶片中等大小、绿色，茸毛较少；铃卵圆型；果枝节位较低，果枝数较少，单株铃数和霜前花率中等，铃重小，衣分高，产量低；在河北省农林科学院棉花研究所小安舍实验站枯黄萎病圃进行抗病性鉴定，其枯萎病指为87.4、黄萎病指为36.2，高感枯萎病和黄萎病。与父本相比，16个母本普遍表现植株较高，果枝节位较高，果枝数较多，铃重大，衣分低，产量高，抗病性好；16个杂交组合的F1和F2代均表现正常。

2.2FBP7-iaaM的基因遗传分析

鉴定结果（表4）显示，父本IF1-1全部表现蓝色，为转FBP7-iaaM高衣分品系；16个母本全部表现为不变色，为非转FBP7-iaaM品种（系）；F1代全部表现蓝色，F2代中变蓝株数与不变蓝株数的比例基本符合3∶1的分离比例。表明IF1-1种质的高衣分性状是由1对显性基因控制的质量性状，即：FBP7-iaaM为显性基因。

表2　亲本、F1代、F2代产量性状和产量的平均值与变化范围Table 2　Mean value and variation range of the yield and yield traits from parents，F1and F2

表3　亲本、F1代、F2代抗病性和农艺性状的平均值与变化范围Table 3　Mean value and variation range of the disease resistance and agronomic traits from parents，F1and F2

表4　亲本、F1代和F2代的组织化学鉴定结果Table 4　Tissue chemistry identification results for the parents，F1and F2

2.3F1代和F2代的杂种优势分析

杂种优势分析结果（表5）显示，与高衣分亲本IF1-1相比，F1和F2代衣分均不具备超中和超亲优势，但与母本相比却具有明显优势，分别较母本平均衣分高3.0%和2.4%；F1代单铃重具备明显的超中优势（16.1%）和超亲优势（4.0%），F2代单铃重具备明显的超中优势（12.7%）但不具备超亲优势（-6.4%）；F1代霜前花率具备负的超中和超亲优势（优势值分别为-4.5%和-5.1%），F2代具备负的超中优势（-5.9%）和较小的超亲优势（1.1%）；F1和F2代子棉和皮棉产量均具备非常明显的超中优势（F1代优势值分别为65.4%和 72.8%，F2代优势值分别达到 43.3%和47.1%），且F1代2个性状也具备超亲优势（优势值分别为7.0%和13.4%），但F2代不具备超亲优势（优势值分别为-7.2%和-3.3%）；F1和F2代枯萎病指和黄萎病指均具备明显的负超中优势（F1代优势值分别为-43.2%和-27.7%，F2代优势值分别为-29.0%和-11.6%），其中，F1代2个性状超亲优势（优势值分别为102.8%和91.2%）明显，而F2代超亲优势（优势值分别高达160.9%和158.1%）更加明显；株高与果枝数的优势变化规律相同，F1和F2代2个性状均具有明显的超中优势（株高优势值分别为19.3%和18.6%，果枝数优势值分别为11.1%和7.6%），但均不具备超亲优势（株高优势值分别为-1.6%和-2.1%，果枝数优势值分别为-2.5%和-5.4%）；F1代单株铃数的超中优势（9.0%）和超亲优势（7.3%）均表现为正，而F2代均表现为负（优势值分别为-3.3%和-4.3%）；F1代第一果枝节位超中优势（4.5%）为正、超亲优势（-7.5%）为负，F2代超中优势（-2.5%）和超亲优势（-13.6%）均为负值。

表5　F1代和F2代的杂交优势Table 5　Heterosis analysis for F1and F2of hybrid combination

综上分析可以看出，（1）虽然与高衣分亲本IF1-1相比，F1和F2代衣分不具备超中与超亲优势，但与16个母本品种（系）相比，却能明显提高现有品种（系）的衣分率；（2）F1代产量尤其是皮棉产量具备较明显的超亲优势，皮棉产量优势值为13.4%，这就意味着可以选择生产上产量较高的品种与IF1-1配制杂交组合，选择高优势杂交种直接利用；（3）F1和F2代的抗病性均明显好于IF1-1，但与母本相比较差，所以，在杂交后代的选择中，要注意观察枯萎病和黄萎病的发病情况，选择抗病性好的后代；（4）子棉产量的提高主要通过铃重和单株铃数的增加来实现，皮棉产量的增加则是通过子棉产量与衣分的共同提高来完成。

2.4杂交后代的选择与应用

2014年筛选，2015年种植，混合法杂交后代3代材料（16份，6001～6014区和6030～6031区）的衣分变异幅度为40.1%～46.4%、铃重为5.7～8.8 g，4代材料（15份，6015～6029区）的衣分变异幅度为34.7%～44.6%、铃重为5.6～7.1 g；分子标记法（GUS检测单株）4代材料（17份，6032～6048区）的衣分变异幅度为42.7%～52.3%、铃重为5.3～7.0 g，未GUS检测单株3代材料（22份，6056～6077区）的衣分变异幅度为35.3%～49.8%；系谱法4代单株材料（29份，6078～6106区）的衣分变异幅度为36.4%～49.1%，5代单株材料（22份，6166～6187区）的衣分变异幅度为37.7%～47.6%。由亲本材料选出3个单株，其中，6112衣分为48.4%，6114衣分为51.8%。

3　结论与讨论

关于IF1-1的报道虽然较多［10，13～15］，但多为国家科技报告和学位论文中应用，且以基础研究为主。而本研究是以该种质的育种应用为目的，研究了该种质的杂种优势利用与后代选择。

杂交种在产量及产量构成因素方面，霜前皮棉产量具有显著的杂种优势，霜前子棉产量次之；衣分、铃重和株高具有明显的杂种优势，单株果枝数次之，子指不具优势，单株结铃数具有负优势［16］。郝俊杰［17］通过比较9个亲本品种的产量和产量组成因素、一般配合力和品种杂种优势的效应值，发现中棉所41、邯郸109、鲁研棉28是杂种优势利用中比较好的亲本，F1代的大多数性状表现群体平均优势，但群体超亲优势的比例偏低。本研究中，与IF1-1配制的杂交组合皮棉产量具备较明显的超亲优势，表明虽然转iaaM高衣分棉花种质IF1-1本身缺点较多，但作为亲本材料仍然是杂种优势利用中比较好的亲本。在棉花杂交育种后代群体中，个体间衣分变化呈正态分布，超低衣分和超高衣分个体出现的几率不多［18］，但并非不能，本研究获得了超高衣分育种材料。

虽然利用转基因技术可以实现棉花种质的突破，但是利用这些种质培育出突破性的棉花品种却离不开现有的育种技术［19～21］。

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Heterosis Analysis and Application for the High Percentage Cotton Germplasm IF1-1 with iaaM

LIU Cun-jing1，JIANG Zhen-xing2，ZHANG Jian-hong1，TANG Li-yuan1，ZHANG Su-jun1，TIAN Hai-yan1，LI Xing-he1，SHI Shu-xin1，CUI Rui-min1，ZHANG Xiang-yun1*
（1.Institute of Cotton，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Cotton in Huanghuaihai Semiarid Area，Ministry of Agriculture，Shijiazhuang 050051，China；2.Hebei Academy of Governance，Shijiazhuang 050031，China）

The high lint percentage germplasm transgenic iaaM lines have been developing，but seldom applied to breeding.We use the high lint percentage germplasm transgenic iaaM lines IF1-1 as the male parents and 16 upland cotton varieties（lines）as female parents to construct the hybrid combinations.We have detected the iaaM hereditary in parents，F1，and F2populations and investigated disease resistance and agronomic traits in the field.Meanwhile through the analysis of the yield components and production statistics in these populations，the hybrid progeny was oriently bred by the means of combination pedigree breeding method and MAS.We have achieved the new germplasm with high lint percentage breeding application.The results showed that（1）FBP7-iaaM gene is dominant gene.（2）Although compared with high lint parents IF1-1，the lint in F1and F2do not have the mid heterosis and heterobeltiosis，it cansignificantlyimprovetheexistingvarieties（lines）lint percentage rate comparing with the 16 female parents varieties（lines）.（3）The F1production has heterosis compared with parents especially in the lint production，the lint yield advantage is 13.4%. That means we could directly select the high production hybrids to use by hybridizing higher yield varieties with IF1-1.（4）The resistance of F1，F2populations is significantly better than IF1-1，but it is worse than the female parent.So we should select the better disease-resistant in the hybrids by observing the incidence of blight and verticillium incidence.（5）By analyzing the advantages traits，indicating that the major increase cotton yield by increasing boll weight and boll number to achieve.But lint yield increasing and improving by the lint and seed cotton yield increased together.（6）The hybrids have high potentiality to selecte new lint lines.The second generation of transgenic cotton germplasm has been obtained，under the support of the national science and technology major projects.In this study，the cotton germplasm is applied to cotton breeding successfully.This is of great significance to improve the level of biological breeding in China.

IaaM；IF-1 line；Heterosis；Application

S512.1+1

A

1008-1631（2016）03-0070-05

2015-12-24

国家转基因重大专项（2014ZX08005-001-004）；河北省科技支撑计划项目 （14226312D）；河北省财政重大专项（F15C2015043759）；河北省财政重大专项（F15C2015043752）

刘存敬（1969-），女，河北辛集人，研究员，主要从事棉花遗传育种研究。E-mail：cunjingliu@sohu.com。

基金项目：张香云（1956-），女，河北行唐人，研究员，主要从事棉花育种及新品种示范推广研究。E-mail：jimianzhang@qq.cn。