“一锅法”合成PCL-b-PEG嵌段聚合物及其自组装行为

李彩今，胡　齐，李玉祥，李亚鹏，王静媛

(吉林大学化学学院，无机合成与制备化学国家重点实验室，吉林 长春 130023)



“一锅法”合成PCL-b-PEG嵌段聚合物及其自组装行为

李彩今，胡齐，李玉祥，李亚鹏，王静媛

(吉林大学化学学院，无机合成与制备化学国家重点实验室，吉林 长春 130023)

利用点击化学与酶促开环聚合相结合的“一锅法”制备聚己内酯-b-聚乙二醇(PCL-b-PEG)两亲性嵌段聚合物.首先通过对二氯代乙氧基乙醇进行叠氮化亲核取代修饰得到了同时引发点击化学反应与酶促开环聚合反应的双官能引发剂;再利用戊炔酸对聚乙二醇炔基化修饰;最后由双官能引发剂的叠氮端基引发炔基化PEG的点击化学，同时在生物催化剂Novozyme-435的催化下利用其羟端基引发己内酯的酶促开环聚合.经核磁共振与GPC的测试对所制备嵌段聚合物结构进行了表征并验证了一锅法合成的可行性.由GPC测试得到相对分子质量为15 093、多分散性良好(1.18)的嵌段聚合物.经过动态光散射测试得到水粒半径为202 nm，而由透射电子显微镜测试所得的干燥状态下粒子半径为146 nm.

酶促开环聚合；点击化学； 一锅法

点击化学作为一种新型的聚合方法自诺贝尔化学奖得主K.B.Sharpless提出以来备受关注[1].它被公认是一种反应方式简单、快速高效、选择性强、产率高的合成方法.因此越来越被广泛地应用于合成领域.而关于己内酯的酶促开环聚合因其所具有的无毒、高效、可回收、立构选择性等诸多优点被不断地研究，其中以其与不同聚合方法结合制备特殊结构聚合物为重点[2-6].Andreas Heise 小组先后利用不同聚合方法合成了一系列嵌段聚合物[7].S.M.Howdle和Holger Frey 等分别在超临界CO2环境下利用化学酶方法一锅合成双嵌段聚合物和接枝聚合物[8-11].近年来关于对点击化学与开环聚合及原子转移自由基聚合反应(ATRP)相结合制备特殊结构聚合物的研究不断被报道，而对于点击化学与开环聚合反应的同时“一锅法”研究却较少[12-13].本文通过双官能引发剂将点击化学与酶促开环聚合反应进行“一锅法”同时聚合制备了PCL-b-PEG两亲性嵌段聚合物，并对其自组装行为进行了研究与表征.PEG由于其自身的稳定性、生物相容性、水溶性、无毒及快速降解的性质被广泛地应用于材料科学与生物技术研究，而疏水聚合物通过链接PEG链段可使其经自组装行为转变成核壳结构胶束，利用该胶束的包覆可在人体循环中防止蛋白质与生物酶的吸附并增加其保留时间.这种聚合物胶束作为基因与药物载体方面有着重要作用.PCL作为一种脂质聚酯由于其良好的生物降解性、生物相容性及无毒性被广泛地应用于生物材料.

1　实验部分

1.1试剂与仪器

试剂：己内酯(ε-CL，Aldrich公司)；聚乙二醇(PEG相对分子质量为2 000，Aldrich公司)；4-戊炔酸、 2-氯乙氧基乙醇(Aldrich公司)；固定化酶Novozyme435(诺维信公司提供)；硫酸镁、中性氧化铝、2，2-联吡啶(bpy)(上海试剂一厂)；叠氮化钠(Fluka)；4-二甲氨基吡啶(DMAP，Fluka)；乙酸乙酯、二甲基甲酰胺(DMF)、乙醚、二氯甲烷、二甲基亚砜(DMSO)、氯化亚铜、四氢呋喃(THF)(北京化学试剂厂).

仪器：核磁共振(NMR)BrukerARX-500；傅里叶变换红外光谱分析仪(FTIR)Bruker IFS66V；GPC测试(Waters410)；Zeta 电位分析仪(Brookhaven Instruments Corporation)；透射电子显微镜(JEOL JEM 2010)；荧光分析仪(Obin YvonSpex Fluorolog 3).

1.2双官能引发剂的制备方法

在100 mL圆底反应瓶中加入2-氯乙氧基乙醇(4 mL，32 mmol)和大过量的叠氮化钠(20 g，160 mmol)，以去离子水(60 mL)为溶剂，在加热搅拌、回流条件下进行亲核取代反应48 h，待反应瓶冷却后，反应溶液用乙酸乙酯萃取，经去离子水洗脱残余叠氮化钠，用无水MgSO4干燥，然后减压蒸除有机溶剂相.

1.3PEG-2000的炔基化处理

将0.6 g 4-戊炔酸(0.006 mol)溶解于DMSO(20 mL)中，在加入0.244 4 g DMAP(0.002 mol)后磁力搅拌活化1 h.在搅拌条件下将10 g PEG(0.005 mol)溶于DMSO(20 mL)中制得PEG溶液，然后将该溶液加入到经活化后的戊炔酸溶液中，在40℃条件下搅拌反应24 h.产物先由无水乙醚沉淀初步提取，粗产物用二氯甲烷再溶解，用1 mol/L盐酸与去离子水各洗3次，用无水MgSO4干燥并过滤，再经减压蒸除有机溶剂相后放入到真空烘箱干燥至恒重.

1.4“一锅法”合成PCL-b-PEG

将用真空干燥24 h的Novozyme435固定化酶(0.108 g)加入到由真空处理的氩气保护的圆底反应瓶中，依次加入0.556 g炔基化PEG与0.04 g联二吡啶，通过反复抽放气体3次，对反应瓶进行无氧处理.将4 mL己内酯、1 mL DMF溶剂、30 μL叠氮引发剂加入到反应体系中，在60℃条件下搅拌反应6 h.粗产物经过中性Al2O3处理提纯后减压除去有机溶剂，将浓缩溶液在乙醚中沉淀，再经乙醚反复洗涤后置于真空烘箱中干燥48 h.干燥产物经四氢呋喃溶解后，装入透析带中，在去离子水中透析除去未反应的炔基化PEG.减压蒸除有机溶剂后真空干燥至恒重.合成PCL-b-PEG的过程见图1.

图1　合成嵌段共聚物 PCL-b-PEG的过程

1.5PCL-PEG产物在水溶液中的自组装行为

将1 mg聚合产物PCL-b-PEG溶解于1 mL四氢呋喃(THF)中，并在超声溶解条件下缓慢滴入20 mL 蒸馏水，出现淡蓝色乳光，室温下继续超声1 h，然后对胶束溶液直接进行DLS测试.取胶束溶液滴于洁净铜网上，干燥后进行TEM测试.

1.6PCL-b-PEG产物临界胶束样品的制备

以上述聚合物胶束水溶液为基础稀释并从5×10-2～5×10-7mg/mL的聚合物溶胶束水溶液获得所需浓度，待用.芘溶液的配制的方法：首先称量一定量的芘，将其溶解于丙酮溶液中，在室温下通过超声使芘完全溶解，得到浓度为4.75×10-5mol/L的芘溶液.分别量取20 μL芘溶液移至9个10 mL的容量瓶中，室温下静置至丙酮完全挥发.然后将配制好的不同浓度的聚合物胶束溶液分别加入到含有芘的9个容量瓶中，定容至10 mL，室温下超声0.5 h使芘能够完全溶解到聚合物胶束水溶液中，室温下放置24 h，待测.测量原则：以发射波长测得最大激发波长，以激发波长测得最大发射波长；用荧光分析仪(obin YvonSpex Fluorolog 3)测试不同浓度含芘的聚合物胶束的荧光发射光谱，激发波长为 335 nm，狭缝宽度为 5 nm.

2　结果与讨论

2.1双官能引发剂的合成

含有端羟基的小分子引发剂被大量的用于引发酶促开环聚合，而对卤代分子的亲核取代是对引发剂修饰的一种简单而且有效的手段[14-16].因此本文采用对2-氯乙氧基乙醇进行叠氮化钠的亲核取代修饰来制备双官能度的引发剂.修饰后产物的核磁谱图见图2.由图2a可见50.19(N3—CH2—)、69.15(N3—CH2—CH2—)、72.63(—O—CH2—CH2—OH)和60.39(—CH2—OH)4个明显的特征峰，这4个吸收峰相对于反应物特征峰位置均发生偏移，证明了修饰的引发剂成功发生[17].

图2　引发剂分子的13C NMR(a)及嵌段聚合物PCL-b-PEG的1H NMR(b)

2.2PEG的炔基化修饰

由于成酯反应是一种常见而且被广泛使用的端基修饰方法[18]，因此本文通过4-戊炔酸与PEG链段端羟基的酯化反应对PEG成功进行了炔基化修饰(见图3)，从图3b中可观察到PEG原有特征峰，并且在3 290 cm-1处出现炔基特征吸收峰，证明对PEG炔基化的修饰成功.由于戊炔酸为过量，因此可保证对PEG端羟基修饰得完全.

2.3“一锅法”合成的PCL-b-PEG产物分析

利用所合成的双官能引发剂引发己内酯与炔基化PEG的“一锅法”聚合反应，从反应产物的核磁共振谱图2(b)可以看出，PCL链段中特征峰(a-c)的出现，证明了引发剂对己内酯的酶促开环聚合反应成功引发，而由PEG链段的特征峰(k，k′，p)与2个点击反应特征峰(g与h)的出现则证明了引发剂对炔基化PEG点击化学反应的引发作用.红外光谱表征见图3.图3(a)产物的红外光谱图中炔基与叠氮基特征吸收峰的消失则进一步证明酶促开环聚合与点击化学反应的同时进行.通过对聚合产物的GPC测试得到对称单峰曲线见图 4，相对分子质量及多分散性分别为15 093与1.18.因此由NMR及GPC分析可证明引发剂同时引发了2种聚合反应并且得到分散性良好的嵌段聚合产物.

图3　引发剂分子(a)、炔基PEG(b)和PCL-b-PEG的红外光谱(c)

图4　嵌段聚合物PCL-b-PEG(a)及炔基PEG凝胶渗透(b)的色谱

2.4聚合物的自组装行为分析

两亲性嵌段聚合物由于其不同嵌段之间的不相容性，因此在水溶液中疏水链段会驱动聚合物链形成球状胶束聚集体，这种胶束聚集体由疏水的PCL链段组成内核，而亲水的PEG链段以溶剂化形式在核周围形成保护壳来维持胶束的稳定.对聚合物自组装行为表征的DLS与TEM测试图见图5，通过TEM测试可观察聚合物胶束的形貌，从图5(b)中可以观察到该纳米粒子呈均匀的球形，胶束粒径约为146 nm[19-20].TEM的测量值则明显小于DLS的测量值(202 nm)，这是由于DLS的测试条件是在溶液状态下，此时聚合物胶束处于溶胀状态，也就意味着聚合物的亲水链段在水溶液中处于伸展的状态，而TEM测试的则是干燥状态下的胶束粒径，因此导致测定值小于DLS得到的粒径.

图5　嵌段聚合物PCL-b-PEG的DLS(a)及TEM(b)

2.5两亲性嵌段聚合物的临界胶束浓度测定

自从1977年Kalyanasundaram等人研究发现芘的荧光发射光谱对溶剂极性的敏感性后，芘就被广泛用做研究水中疏水微区形成的灵敏而有效的荧光探针.它的荧光强度会随着其周围环境极性的变化而变化，因此可以测试溶剂的环境.在芘的荧光光谱中有16个峰，用I代表峰的强度，则第1峰和第3峰强度之比(I1/I3)可用来判断所检测到的环境极性是否发生变化.当溶液中聚合物浓度过低而无法形成胶束时芘的I1/I3值与其在水溶液中的I1/I3值相同.而当聚合物的浓度达到可以形成胶束的浓度并形成胶束时，较强的疏水性会富集于疏水内核.由于芘的环境极性发生改变，它的I1/I3值也急剧变化.因此可用芘为荧光探针来测定聚合物初始形成胶束时的浓度值，即临界胶束浓度(CMC).将含芘两亲性嵌段共聚物胶束溶液荧光测试的I1/I3值与胶束浓度lgc作图，所得结果见图6.从图6(b)中切线交点可得出聚合物CMC为0.002 3 mg/mL[21].

图6　不同浓度嵌段聚合物PCL-b-PEG水相中荧光光谱(a)及不同浓度PCL-b-PEG荧光光谱I1/I3的比值分析(b)

3　结论

通过将酶促开环与点击化学反应相结合的“一锅法”合成PCL-b-PEG两亲性嵌段聚合物，并对聚合物在水溶液中的自组装行为进行了研究.利用双官能引发剂对2种不同反应进行同时引发聚合，利用核磁表征证明了产物的结构，GPC测试则证明得到了相对分子质量为15 093、多分散性为1.18的目标聚合产物.通过DLS与TEM测试对其自组装行为进行了研究，得到胶束在溶液与干燥条件下的直径分别为202与146 nm.由于PCL与PEG均具有良好的生物相容性和可降解性使产物具有很好的医药应用前景，同时本文的“一锅法”合成具有反应简单可控的优点外还克服了多步反应繁琐与提纯困难的缺点，因此其潜在应用价值有待于进一步研究与探索.

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(责任编辑：石绍庆)

Synthesis of PCL-b-PEG block polymer by “one-pot” and its self-assembly behavior research

LI Cai-jin，HU Qi，LI Yu-xiang，LI Ya-peng，WANG Jing-yuan

(State Key Laboratory of Inorganic Synthesis & Preparative Chemistry，School of Chemistry，Jilin University，Changchun 130023，China)

Biodegradable and biocompatible PCL-b-PEG amphiphilic block copolymers were prepared by combination of Enzymatic ring-opening polymerization and “click” chemistry via “one-pot” method under mild conditions.First the bifunctional initiator was prepared by chlorinated ethoxy ehanol which was displaced by azide nucleophilic and additionaly the polyethyleneglycol was modified by utilized pentynoic acid.Ultimately，the bifunctional initiator initiated click chemistry and enzymatic ring-opening polymerization in the present of biocatalyst Novozyme-435.Click chemistry of the alkynylation PEG was initiated by azido-ended of the bifunctional initiator，simultaneously enzymaic ring-opening polymerization was triggered by the other hydroxyl-ended with the present of biocatalyst Novozyme-435.The composition and block architecture of the copolymers were characterized by1H NMR，FTIR and GPC analyses.These amphiphilic block copolymers could self-assemble into sphere-like aggregates in aqueous solution with diverse diameters.The size and shape of the block-copolymers micelles were investigated by using dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscope(TEM).The results of DLS and TEM indicate that the copolymers micelles appear a spherical shape and had a mean diameter (146 nm).

enzymatic ring-opening polymerization；click chemistry；onepot

1000-1832(2016)03-0104-06

2014-11-28

国家自然科学基金资助项目(20904014).

李彩今(1964—)，女，博士，讲师，主要从事无机合成与制备研究；通讯作者：李亚鹏(1978—)，男，博士，教授，主要从事医用高分子材料研究.

O 631[学科代码]150·45

A

[DOI]10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.03.020