小麦族植物淀粉粒形态研究

万智巍，李明启，李姮莹

(1.中国科学院地理科学与资源研究所/陆地表层格局与模拟院重点实验室，北京 100101；2.鄱阳湖湿地与流域研究教育部重点实验室/江西师范大学地理与环境学院，江西南昌 330022)

小麦族植物淀粉粒形态研究

万智巍1,2，李明启1，李姮莹2

(1.中国科学院地理科学与资源研究所/陆地表层格局与模拟院重点实验室，北京 100101；2.鄱阳湖湿地与流域研究教育部重点实验室/江西师范大学地理与环境学院，江西南昌 330022)

为深入研究小麦族植物的淀粉粒形态特征，利用光学显微镜和电子显微镜对收集于中国的16种小麦族植物淀粉粒形态进行分析。结果表明，小麦族植物淀粉粒均为单粒淀粉粒，二维形状上大多为近圆形，部分呈椭圆形。从淀粉粒组合形式上来看，16个样品均包含有A型(>10 μm)和B型(<10 μm)淀粉粒。其粒径大小与圆度存在正相关关系(R2=0.401 3)，即平均粒径越大，其圆度越高，在二维形态上越接近正圆。聚类结果表明，16个样品可以分为5类，鹅观草与黑麦淀粉粒差异最为明显，各为一类；二棱皮大麦、六棱皮大麦、披碱草、硬粒小麦为第三类；斯卑尔托山羊草、野生大麦、大麦为第四类；二棱裸大麦、新疆大麦、六棱裸大麦、纤毛鹅观草、春小麦、小麦无芒蚂蚱、野生二粒小麦为第五类。根据多变量分析结果，提出了小麦族植物淀粉粒鉴定的判别方程式。研究成果充实了小麦族植物淀粉粒数据库和图谱。

小麦族；淀粉粒；形态；多变量分析

麦类作物在中国尤其是北方被大面积种植，是人们的主要食物来源。目前普遍认为它们是在一万年以前的西南亚地区被驯化[1]，在距今4 500～4 000年间传入中国。麦类作物的传入从根本上动摇了中国北方旱作农业的种植传统，促使当地由依赖粟类向麦类作物转化[2]。特别是在文明的早期，人类可能驯化和利用了各种小麦族植物。为了更好地了解小麦族植物的利用过程，很多学者开始尝试利用不同分析方法进行各种小麦族植物的鉴定和分类工作。如甯顺腙等[3]研究了小麦族11个种的叶绿体psaC基因序列，进行了系统学和遗传多样性分析。还有学者利用核型分析方法，研究了鹅观草、赖草等5种小麦族植物的分类和演化关系[4]。但是以往的研究大多集中于目前人类主要栽培的小麦、大麦等，较少系统研究其他的品种。因此，本研究通过收集中国常见的小麦族植物并对其进行淀粉粒分析，利用光学显微镜和电子显微镜构建中国常见小麦族植物淀粉粒数据库和图谱，以期为小麦族植物研究提供基础资料和数据。

1　材料与方法

1.1试验材料

全世界小麦族植物约有20个属，我国连同栽培种约有170多个种[5-6]。本研究选取了分布于我国的小麦属(Triticum)、大麦属(Hordeum)、披碱草属(Elymus)、黑麦属(Secale)、山羊草属(Aegilops)、鹅观草属(Roegneria)等6个属共计16个种的小麦族植物进行淀粉粒分析(表1)。

表1　供试小麦族植物样品名称

1.2试验方法

植物样品淀粉粒提取及光学显微镜观察：每种样品分别取一粒籽粒放入15 mL一次性塑料试管中，加入3 mL超纯水，浸泡6～12 h；用玻璃棒轻碾样品使其充分破碎，静置30 min后搅拌均匀；取100 μL淀粉悬浮液滴于载玻片上，待稍干后，加入50 μL浓度为20%的甘油，并用无色指甲油封片。在OLYMPUS BX-51生物显微镜下放大400倍观察并用数码相机拍照，记录淀粉粒类型(单粒、复粒、半复粒)、大小(长度、宽度)、二维形状、三维形状、表面形状及结构、层纹、裂隙、脐点位置等特征。挤压盖玻片，观察淀粉粒形态特征变化，并拍照记录。

植物颖果扫描电子显微镜分析：用镊子夹住颖果两端，用力使其自然断裂为两段；将一段粘附在样品台上，使断裂面朝上，放置于E-1045型离子溅射仪样品舱中，在15 mA电流下喷金60～90 s；将样品取出，放入HITACHI S-3400N扫描电子显微镜中，在2 000倍放大观察并拍照。

1～16:样品编号。图3和图6同。　　1-16：Sample No..The same as in Fig.3 and Fig.6.

利用SPSS 20统计分析软件将定性和定量描述数据转化为多变量分析数据，利用主成分分析、聚类分析等方法对淀粉粒进行归类和区分。

2　结果与分析

2.1淀粉粒基本特征

根据16个样品的光学显微镜和电子显微镜图谱(图1)可知，被测样品的淀粉粒均为单粒淀粉粒。二维形状上大多为近圆形，部分呈椭圆形；三维形态均与铁饼或扁状圆柱体比较接近，其厚度约为3～7 μm，粒径与厚度的比值约为5∶1。从淀粉粒组合形式上来看，16个样品的淀粉粒均由A型(>10 μm)和B型(<10 μm)[7-8]淀粉粒构成。

电子显微镜观察结果显示，小麦族植物淀粉粒有着不同大小的淀粉粒组合形式。以黑麦为例，图1(12B)、图2A和图2B分别为2 000倍、5 000倍和10 000倍的照片。从图2A可以看出黑麦淀粉粒可以分为大小两组，一组粒径为22.30 μm，另一组粒径为2～6 μm。同时可以观察到黑麦淀粉粒表面分布有很多小凹坑。通过对10 000倍扫描电镜放大照片的观察，可以发现黑麦淀粉粒中还有些更小的淀粉粒(图2B)，其粒径约0.8 μm。

图2　黑麦淀粉粒扫描电子显微镜照片(A:5 000倍;B:10 000倍)

图3　淀粉粒粒径箱线图

2.2淀粉粒粒径的差异

测定样品通过淀粉粒中心的直径，利用Origin 8.0统计软件绘制16个样品的粒径箱线图(图3)。从图3可以看出，被测植物淀粉粒粒径的分布存在差异。从平均粒径来看，黑麦的粒径最大，为25.22 μm，其次是斯卑尔脱山羊草，为17.03 μm，鹅观草、春小麦、无芒蚂蚱小麦、野生二粒小麦及硬粒小麦均小于10 μm，其他几个样品的平均粒径在10～15 μm之间。从最大粒径来看，除了披碱草和鹅观草小于20 μm外，其他均大于20 μm，最大值为黑麦，达到43.43 μm，斯卑尔脱山羊草和六棱裸大麦淀粉粒粒径最大值也都超过了30 μm，其他的介于20～30 μm之间。考虑到粒径较小的淀粉粒没有鉴别特征，在只考虑粒径大于10 μm的淀粉粒时，黑麦的平均粒径仍然最大，为30.31 μm，其次是六棱裸大麦(22.68 μm)，第三是斯卑尔脱山羊草(21.00 μm)，鹅观草最小，仅为12.15 μm。

2.3淀粉粒二维形状的差异

本研究中16种小麦族植物的淀粉粒在形态上基本都是圆形和椭圆形，但是样品的二维形状之间存在不同程度差异。从图1可以观察到，披碱草淀粉粒的形状较不规则，而大麦、黑麦的淀粉粒较为规则，接近正圆形。由淀粉粒圆度的测量结果(表2)可知，16个样品的圆度存在差异，其中黑麦淀粉粒圆度为0.917，接近于正圆的圆度值1。而硬粒小麦淀粉粒的圆度则为0.752。

为了对小麦族植物粒径大小与圆度的关系做进一步了解，将样品的平均粒径值与样品的圆度值进行相关分析。根据SPSS软件计算的结果(图4)可知，粒径大小与圆度之间存在显著正相关(R2=0.401 3)，即平均粒径越大，其圆度也就越高，在二维形态上也就越接近正圆形。

2.4多变量分析

利用多变量分析方法，综合显微镜观察结果提取出的变量因子，通过SPSS 20软件构建判别方程式并进行主成分分析和聚类分析。

2.4.1变量指标体系的选取

在淀粉粒形态指标的选取上，综合参考相关学者提出的方案[9-11]，选取以下10个指标作为本次淀粉粒分析的变量(表3)。所选取的指标可分为名义变量和几何变量两大类。名义变量主要是指示某一现象是否出现，如是否出现层纹、脐点等，统一使用0表示不出现，1表示出现。而几何变量则是某些可以具体测量的特征，如粒径值、圆度值等。

表2　淀粉粒圆度

图4　淀粉粒粒径与圆度的关系

表3　小麦族植物淀粉粒的形态指标

2.4.2主成分分析

根据表3中所列的变量逐项对16个样品淀粉粒进行数值标定，并输入SPSS 20统计软件中。按照主成分分析方法对这10个变量进行主成分转换，提取出载荷量最大的两个主成分：FAC1和FAC2，并以此绘制出散点图(图5)。从图5可以看出，不同淀粉粒形态指标具有不同的表征特性。如主成分1中的粒径均值(JZ)、标准差(BZC)和主成分2中的挤压面(JYM)、凹坑(AK)、消光臂(XGB)等指标相对较高，这说明利用淀粉粒的大小和表面的关键性特征在进行不同种属淀粉粒的鉴别中具有重要作用。

图5　主成分散点图

2.4.3聚类分析与鉴定结果

将上一节所确定的变量值输入SPSS 20软件中进行聚类分析，聚类的结果见图6。

由图6A可知，16个样品可以聚为5大类，第一类：鹅观草(11)；第二类：黑麦(12)；第三类：二棱皮大麦(5)、六棱皮大麦(9)、披碱草(2)和硬粒小麦(16)；第四类：斯卑尔托山羊草(1)、野生大麦(3)和大麦(6)；第五类：二棱裸大麦(4)、新疆大麦(7)、六棱裸大麦(8)、纤毛鹅观草(10)、春小麦(13)、小麦无芒蚂蚱(14)、野生二粒小麦(15)。

图6　小麦族植物淀粉粒样品聚类树形图(A)和因子得分散点图(B)

对样品进行主成分分析，得出样品的判别方程为(数据后的字母为表3中的变量名)：X=0.205CW+0.152AK-0.096LX+0.112DX+0.32JZ+0.273BZC+0.243YD-0.086QD-0.003JYM-0.052XGB；Y=-0.057CW+0.337AK+0.23LX+0DX+0.103JZ+0.073BZC-0.024YD+0.181QD+0.277JYM-0.269XGB。由此得出5大类样品的分类图(图6B)。由图6B可知，此图与聚类分析图结果一致。

3　讨论与结论

3.1观察淀粉粒表面特征和形态的方法

表面形态是进行淀粉粒鉴定的关键要素，以往相关小麦族植物淀粉粒鉴定研究大多通过光学显微镜来进行淀粉粒表面形态观察。如Piperno等[1]通过光学显微镜下淀粉粒侧面的横穿裂隙鉴定小麦族植物。光学显微镜和扫描电子显微镜在进行淀粉粒的观察方面各有优缺点，光学显微镜可以较直观的观察淀粉粒表面的形貌特征，但是放大倍数有限，一般都是在400倍下进行观察。如果要进行1 000倍放大观察，则需要油镜。而且由于放大倍数较大，光线不足，照片拍摄效果也较差。S-3400N扫描电子显微镜理论上可以进行5～300 000倍的放大观察，但当观察倍数超过10 000倍之后，扫描电子显微镜发射出的电子束会在淀粉粒表面灼烧出深坑，对淀粉粒造成破坏。之所以会出现这种状况，很可能是因为淀粉粒主要是由C、H、O等元素构成的有机质，在强大的电流下被氧化所致。

本次研究选择了2 000倍、5 000倍和10 000倍分别对16个样品淀粉粒进行扫描电子显微镜观察。结果表明，全部样品在淀粉粒形态上可以分为大小两组，这与韦存虚等[7]对小麦淀粉粒的研究结果一致。同时可以在扫描电镜下观察到淀粉粒表面分布有很多小凹坑，这也与光学显微镜的观察结果相同。更高倍数的电子显微镜观察表明，有粒径在0.8 μm左右的淀粉粒存在，这是光学显微镜难以观察到的。因此，综合利用这两种方法可以提高淀粉粒形态研究的精度。

3.2淀粉粒圆度与粒径的关系

以往在进行淀粉粒二维形态的研究时，往往是进行定性的描述，而缺少具体指标的定量测量。近年来很多学者开始利用一些图像分析软件进行系统的形态分析[12]，如美国国家卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)开发的ImageJ软件。利用这一软件可以准确、快速的测量淀粉的粒径、圆度等指标。本次研究的结果表明，淀粉粒粒径大小与圆度之间存在一定的正相关，即平均粒径越大，其圆度也就越高，在形状上也就越接近正圆。因此，淀粉粒圆度值的精确测量也为淀粉粒鉴定和判别提供了一个新的指标。

3.3淀粉粒的判别

未知淀粉粒的判别既需要观察者根据相应的经验进行初步判断，更需要借助必要的计量方法进行判断。以往研究一般是根据淀粉粒的形状和粒径大小判断未知淀粉粒的来源，但对其具体的种属判断尚有一定难度。本研究根据多变量分析的结果，提出利用判别方程式的方法，进一步对植物淀粉粒进行区分。对未知种属的小麦族淀粉粒，可以先按照表3中所列变量分别进行属性赋值和测量，随后代入判别方程式中计算出相应的X和Y值。最后将所得的X和Y值绘图，根据其与已知淀粉粒的距离进行判别。

3.4影响淀粉粒分类的因素

本研究将16个样品分成了5类，鹅观草和黑麦由于在粒径和表面特征上的独特性，与其他样品差异较明显，各自单独归为一类。二棱皮大麦、六棱皮大麦、披碱草和硬粒小麦归为一类，其主要特征是淀粉粒粒径大小居中，表面有凹坑、挤压面，部分表面有裂隙。斯卑尔托山羊草、野生大麦和大麦等归为一类，其主要特征是粒径均值和圆度值居中、部分表面有凹坑，但是三者淀粉粒粒径的标准差较大，说明其淀粉粒组合中同时分布有大小两组淀粉粒，并且粒径值较为分散。其余7个样品淀粉粒归为一类，其特征主要表现在粒径均值和标准差的值居中、圆度较高、表面较为光滑，这也与人类主要食用和种植的普通小麦淀粉粒的形态特征接近。该类中的春小麦和小麦无芒蚂蚱本身就是现在种植的小麦品种，这也从另一个方面说明了聚类分析结果的有效性。但是大麦和新疆大麦为同一个品种，却分为两类，究其原因可能为不同区域的环境条件差异导致淀粉粒粒径等特征存在一定差异造成的。相关研究表明麦类作物淀粉粒中大小两组淀粉粒的比例和蛋白质等成分的含量会受到土壤含水量、基因型等因素的影响[13-14]，温度和CO2浓度、环境因素的差异[15]也有可能对小麦淀粉粒的形成造成一定的影响，本试验的结果也在一定程度上验证了这一观点。

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Study on Morphological Characteristics of Starch Granules in the Triticeae

WAN Zhiwei1,2, LI Mingqi1, LI Hengying2

(1.Key Laboratory of Land Surface Pattern and Simulation/Institute of Geographical Sciences and Natural Resources Research, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;2.Key Laboratory of Poyang Lake Wetland and Watershed Research Ministry of Education/School of Geography and Environment, Jiangxi Normal University, Nanchang, Jiangxi 330022, China)

In order to study morphological characteristics of starch granules in the Triticeae, sixteen samples were analyzed by light microscopy and electron microscopy. The results show that starch granules of Triticeae are almost single granule with round shape. But there are still a few starch granules show oval shape. For the composition of starch granules, all of the 16 samples contain two groups of starch granules, designated as group A(>10 μm) and group B(<10 μm). There is a certain positive correlation between starch granule size and roundness(R2=0.401 3), which means the larger average starch granle size usually come with the higher roundness. The result of cluster analysis shows that 16 samples can be divided into five categories.Category 1:Roegnesiakamojiohwi; category 2:Secalecereale; category 3:Hordeumvulgare(two-rowed),Horduemvulgare(six-rowed),ElymusdahuricusandTriticumturgidumvar.durum; category 4:Aegilopsspeltoidestauschii,HordeumagriocrithonandHordeumvulgare; category 5:Hordeumdistichon,Hordeumvulgarefrom Xinjiang,Hordeumvulgare(six-rowed hulless),Roegneriaciliasis,Triticumaestivum(spring wheat),Triticumaestivum(without awn) andTriticumturgidumvar.dicoccoides.According to the results of the multivariate analysis, discriminant equation is proposed for the Triticeae starch granules identification, which provides the appropriate standards and methods for the identification of future work. This research will contribute to the starch granule database of modern Triticeae plants in China.

Triticeae; Starch granule; Morphology; Multivariate analysis

2016-03-07

2016-03-21

国家自然科学基金项目(41201200)

E-mail：wzw3392008@sina.com

李明启(E-mail：limq@igsnrr.ac.cn)

S512.1；S311

A

1009-1041(2016)08-1020-08

网络出版时间：2016-08-01

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160801.1120.014.html