生地提取物对接种H9亚型禽流感疫苗雏鸡非特异性免疫功能的影响

刘　昭，陈立功，武现军*，刘　佳，郭　莉

(1.河北农业大学动物医学院，河北保定 071000; 2．保定市冀农动物药业有限公司研发部，河北保定 071000)



生地提取物对接种H9亚型禽流感疫苗雏鸡非特异性免疫功能的影响

刘昭1，陈立功1，武现军1*，刘佳2，郭莉2

(1.河北农业大学动物医学院，河北保定 071000; 2．保定市冀农动物药业有限公司研发部，河北保定 071000)

本试验旨在研究生地提取物对雏鸡非特异性免疫功能的影响，采用单因素分组设计，选用1日龄雏鸡随机分为6组饲喂基础日粮，于14日龄接种H9亚型禽流感疫苗，每组分别给予以下处理：生地提取物添加组(Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组)，分别在基础日粮中添加1、2、3 g/L生地提取物；黄芪多糖组(Ⅳ组)，在基础日粮中添加0.4 mL/L黄芪多糖；免疫不给药组(Ⅴ组)，接种H9亚型禽流感疫苗并饲喂基础日粮，空白组(Ⅵ组)，不免疫H9亚型禽流感疫苗只饲喂基础日粮。药物添加期为7 d，对鸡群在14、21、28、35、42、49、56日龄进行心脏采血，进行白细胞计数、溶菌酶以及IFN-α、TNF-α含量测定。结果表明，在7周采样周期内，与空白组相比，黄芪多糖和生地提取物的添加能不同程度的促进雏鸡白细胞的增殖，提高溶菌酶和IFN-α、TNF-α的含量(P<0.05)。其中，中药添加组(Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组)较空白组(Ⅵ组)的白细胞数目有显著增加(P<0.05)，而中剂量组(Ⅱ组)与黄芪组(Ⅳ组)无显著差异(P>0.05)，35日龄时中剂量组和黄芪组较高、低剂量组(Ⅰ组)能显著增加雏鸡溶菌酶和TNF-α的含量(P<0.05)，14日龄～28日龄，生地提取物中剂量组和高剂量组与黄芪组的IFN-α含量无显著差异(P>0.05)，与空白组(Ⅵ组)差异显著(P<0.05)。综上所述，生地提取物具有增强雏鸡非特异性免疫功能的作用，可以作为一种新型的免疫增强剂，建议生地提取物在雏鸡日粮中的添加剂量以2 g/L为宜。

雏鸡；地黄；黄芪多糖；非特异性免疫；H9亚型禽流感疫苗

非特异性免疫又称先天免疫或固有免疫，是机体在长期进化过程中与病原微生物相互作用并逐渐建立起来的一系列防御功能。非特异性免疫对各种入侵的病原微生物能做出快速反应，同时对特异性免疫的启动和效应过程起着重要作用，机体非特异性免疫功能的高低直接影响到机体的抗病能力和生产能力[1]。

我国中草药资源十分丰富，价格低廉，且使用后在畜产品中无有害残留。探索中草药增强免疫功能作用已成为当今兽药和饲料添加剂的研发趋势之一。研究表明，地黄具有滋阴清热、凉血补血作用，地黄多糖可明显提高小鼠的脾指数、胸腺指数，改善血清中IL-2和IL-4水平，增强单核巨噬细胞的吞噬功能[2]。生地黄富含多糖，其总糖的含量可达16.59%，经过炮制的熟地黄多糖的含量只有3.33%[3-4]，目前，有关地黄对家禽免疫功能的作用尚未见报道[5-6]。本试验采用生地提取物拌料饲喂雏鸡，分析雏鸡的非特异性免疫指标,研究其提高雏鸡的免疫能力,以期为生地提取物的临床应用和市场推广提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1药物科研中试产品生地提取物为低温真空煎煮、减压浓缩并喷雾干燥而得的粉剂，总糖含量≥70%，由保定市冀农动物药业有限公司研制并提供；黄芪多糖粉(Astragaluspolysaccharides，APS)购自生泰尔生物科技集团，批号为1410281，多糖含量≥45%

1.1.2疫苗H9 亚型禽流感疫苗(F株)由南京梅里亚生物制品有限公司生产，产品批号15012548。

1.1.3试验用动物1日龄海兰灰蛋鸡雏，公母雏各半，购于河北华裕家禽育种有限公司。试验鸡饲养于河北农业大学畜牧教学基地小动物舍，笼养，内设水线，第1周时鸡用饮水壶饮水，1周后使用水线饮水。

1.1.4主要试剂白细胞染液为自配:第1液为中性红25 mg，氯化钠0.9 g，蒸馏水100 mL；第2液为结晶紫12 mg，柠檬酸钠3.8 g，100 mL/L甲醛0.8 mL，蒸馏水100 mL。分别过滤后备用；溶菌酶(LZM)检测试剂盒(比浊法)，南京建成生物工程研究所产品(批号：20150703)；鸡α干扰素(IFN-α)ELISA检测试剂盒，北京莱博泰瑞科技发展有限公司提供(批号：20150702)；鸡肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA检测试剂盒，北京莱博泰瑞科技发展有限公司提供(批号：20150702)。

1.2方法

1.2.1动物分组选用1日龄的海兰灰雏鸡1 200只，淘汰弱雏后，随机分成6组，每组200只。育雏14日龄后，开始接种H9亚型禽流感疫苗并在基础日粮中添加如下药物：生地提取物低、中、高剂量组(Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组)分别添加1、2、3 g/L生地提取物，黄芪组(Ⅳ)添加0.4 g/L的黄芪多糖。免疫不给药组(Ⅴ组)和空白对照组(Ⅵ组)饲喂基础日粮，投药至21日龄，6组海兰灰雏鸡在相同的条件下饲养，自由式饮水，每天观察试验雏鸡的生长和健康情况，每天清扫鸡舍，鸡舍内悬挂温湿度计，早、晚分别记录鸡舍内温度和湿度，控制温度湿度保持在同一条件下，每天定时通风换气处理，饲养至56日龄。其中生地提取物高、中、低剂量的确定参照预试验中对生地提取物毒性试验；黄芪多糖组的黄芪多糖粉的添加剂量按照说明书的推荐剂量添加(0.4 g/L)。以上各组鸡除空白对照组外，于14日龄分别颈部皮下注射H9亚型禽流感灭活疫苗，0.3 mL/只。

1.2.2采样方式于14、21、28、35、42、49、56日龄时每组随机选取15 只采血(采血后淘汰)，将血液分为2份，1 份加肝素抗凝，用于白细胞计数；1 份在采血后常规分离血清备用，用于检测血清中溶菌酶、IFN-α和TNF-α的含量。

1.2.3检测方法外周血白细胞计数方法采用直接染色计数法。

血清中溶菌酶含量的测定采用空白对照法，严格按照试剂盒说明进行。

血清中IFN-α和TNF-α的测定(双抗夹心ELISA法)严格按照试剂盒操作要求操作,用酶标仪测定OD 450 nm值，绘制标准曲线。最后根据标准曲线计算各样品中IFN-α和TNF-α含量[7]。

1.2.4数据统计分析采用Excel对试验数据进行初步处理，用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，并进行多重比较，结果用“平均值±标准差”表示，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2　结果

2.1生地提取物对雏鸡外周血白细胞数量的影响

结果见表1。从表1可以看出，在给药前(14日龄)，各组白细胞总数均无显著差异(P>0.05)；21、28、35日龄时，中药添加组(Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组)、免疫对照组(Ⅴ组)和空白对照组(Ⅵ组)存在显著差异(P<0.05)，但生地提取物组(Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组)与黄芪组(Ⅳ组)无显著差异(P>0.05)。21、28日龄时，1、2、3 g/L的添加量均能显著增加白细胞数量(P<0.05)，且3个添加剂量之间无显著差异(P>0.05)。42日龄，中剂量组(Ⅱ组)与黄芪组无显著差异(Ⅳ组)(P>0.05)，与高、低剂量组存在显著差异。42日龄后，各试验组的白细胞数目出现下降趋势，此时，中药添加组(Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组)白细胞数目仍然显著高于空白组(Ⅵ组)(P<0.05)，

表1　各组白细胞总数的动态变化

注:同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

Note:In the same column，values with different small letters mean significant difference (P<0.05)；while with the same letters mean no significant difference (P>0.05).

2.2生地提取物对血清中溶菌酶含量的影响

溶菌酶的动态变化见表2。给药前14日龄时，各组血清溶菌酶含量均无显著性差异(P>0.05)。给药后的各个检测日龄，给药组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组)较免疫对照组(Ⅴ组)和空白对照组(Ⅵ组)均能不同程度的提高机体的血清溶菌酶含量，且显著高于免疫对照组(Ⅴ组)和空白对照组(Ⅵ组)(P<0.05)，28日龄时，给药组溶菌酶含量达到峰值，生地提取物中剂量组溶菌酶含量显著高于高剂量组和低剂量组(P<0.05)，与黄芪组无显著性差异(Ⅳ组)，在监测周期中，生地提取物2 g/L的添加效果显著高于1 g/L和3 g/L的添加效果(P<0.05)。

表2　各组溶菌酶的动态变化

注:同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

Note:In the same column，values with different small letters mean significant difference (P<0.05)；while with the same letters mean no significant difference (P>0.05).

2.3生地提取物对血清中IFN-α含量的影响

IFN-α含量的动态变化见表3。14日龄时，各组血清中IFN-α含量均无显著差异(P>0.05) ；给药后的各个检测日龄，添加中药能显著提高血清中IFN-α含量(P<0.05)，生地提取物中剂量组(Ⅱ组)和黄芪组(Ⅳ组)血清IFN-α含量显著高于免疫对照组(Ⅴ组)和空白对照组(Ⅵ组)(P<0.05)，在35日龄时达到峰值，此时中剂量组与黄芪组的IFN-α含量显著高于其他4组(P<0.05)，生地提取物低剂量组与高剂量组IFN-α含量均值较中剂量组的略低。

表3　各组IFN-α含量的动态变化

注:同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

Note:In the same column，values with different small letters mean significant difference (P<0.05)；while with the same letters mean no significant difference (P>0.05).

2.4生地提取物对血清中TNF-α含量的影响

结果见表4。从表4可以看出，在14日龄时，各组血清中TNF-α含量均无显著差异(P>0.05) ；给药后的各个检测日龄，添加中药能不同程度的提高机体血清TNF-α含量。14日龄至28日龄，各组血清中TNF-α含量呈现上升趋势，此时生地提取物高、中剂量组(Ⅱ、Ⅲ组)和黄芪组(Ⅳ组)之间无显著差异(P>0.05)，与免疫对照组(Ⅴ组)和空白对照组(Ⅵ组)存在显著差异(P<0.05)。35日龄时，血清中TNF-α含量达到峰值，中剂量组(Ⅱ组)与黄芪组(Ⅳ组)无显著差异(P>0.05)，与高低剂量组存在显著差异(P<0.05)，此后，血清中TNF-α含量呈现下降趋势，各给药组的含量与免疫对照组(Ⅴ组)和空白对照组(Ⅵ组)存在显著差异(P<0.05)。

3　讨论

白细胞在免疫系统中扮演着重要角色,在非特异性免疫和特异性免疫中发挥着重要作用，白细胞中的粒细胞、单核细胞和淋巴细胞都与机体的免疫功能有密切联系。因此,通过测定血液中白细胞的数量，可以反映出机体的免疫功能。有研究证明，中药多糖可以促进白细胞数量升高[8]。本研究结果显示，添加生地提取物的3个剂量组均可以增加血液中白细胞的数量，而中剂量组的白细胞数量显著高于高、低剂量组的，说明生地提取物促进免疫的作用在一定剂量范围内可以发挥最佳药效。

表4　各组TNF-α含量的动态变化

注:同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

Note:In the same column，values with different small letters mean significant difference (P<0.05)；while with the same letters mean no significant difference (P>0.05).

溶菌酶是机体防御微生物入侵最为有效的因子之一。文献报道，检测吞噬细胞的吞噬功能和血清溶菌酶的活力，可估测机体的非特异性免疫功能[9-10]。溶菌酶主要来自中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞的溶酶体，本研究中，添加不同剂量的生地提取物均可以增加血清中溶菌酶的含量，推测生地提取物作用于机体后激活了溶酶体,从而产生并释放出溶菌酶[11-12]，同时白细胞数量的增加也可以使溶菌酶的含量增加。

干扰素具有很强的免疫调节作用，它可以调节T、B淋巴细胞的免疫功能，IFN-α能够诱导一系列细胞内蛋白的表达,继而发挥抗病毒、促进细胞增殖和调节免疫应答的作用。本试验中，生地提取物的添加均可以增加血清中IFN-α的含量，并且中剂量组IFN-α含量显著高于高、低剂量组的，这与赵迎虎等发现中药复方能显著增加小鼠白细胞数量，增加血清溶菌酶和IFN-α含量的结果一致[13]。推测血液中的白细胞可以产生IFN-α，因此白细胞数量的增加使IFN-α含量增加，说明白细胞和淋巴细胞数量的增长在一定程度上影响了血液中IFN-α的含量。试验中，IFN-α含量在35日龄达到峰值，而白细胞数量在42日龄达到峰值，推测血液中IFN-α的含量除了受白细胞数量影响以外，还有其他因素参与其中，同时，考虑由药物的刺激引起调控IFN-α的基因大量翻译和转录，某些信号传导通路激活，最终导致IFN-α的激增。

TNF 具有众多免疫活性，TNF-α可直接杀伤肿瘤细胞，具有类似干扰素的抗病毒作用，可促进细胞表达 MHCⅠ类抗原 ,增强对病毒感染细胞的杀伤作用[14-15]。TNF-α 参与单核巨噬细胞的活化及自分泌的调节作用，促进单核巨噬细胞及其他细胞产生IL-1、IL-6等细胞因子以及TNF-α本身的生成[16]。黄峰等发现，加味寿胎胶囊可以显著提高乙型肝炎免疫耐受患者血清中TNF-α的含量，具有突破乙型肝炎免疫耐受的作用[17]。陈培荣研究发现20 g/L的蛇附子添加物可以显著提高肉鸡的TNF-α含量[18]。本研究发现，添加生地提取物和黄芪多糖均可以促进血清中TNF-α的合成，且添加2 g/L的生地提取物可以大幅度提高TNF-α含量。

本研究通过7周采样监测发现，一定剂量的生地提取物可以增加机体的白细胞数量、溶菌酶、IFN-α和TNF-α的含量，说明生地提取物在一定程度上具有与黄芪多糖类似的增强免疫功能的效果，生地提取物对构建机体非特异性免疫屏障具有积极影响。当添加量适宜时，对雏鸡的非特异性免疫功能有促进作用,过量反而不能达到更好的效果，这种现象可能与免疫系统的自稳调节机制有关，考虑到本试验所用生地提取物由水提物纯化而成，有效成分浓度较高[19]，其促进非特异免疫功能的具体机制尚待进一步研究。

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Effect of Radix Rehmanniae Extract on Nonspecific Immunity of Chicks Inoculated with H9 Subtype Influenza Vaccine

LIU Zhao1，CHEN Li-gong1，WU Xian-jun1，LIU Jia2，GUO Li2

(1.College of Veterinary Medicine,Hebei Agricultural University，Baoding，Hebei, 071001，China；2.ResearchandDevelopmentDepartmentofBaodingJinongAnimal'sPharmaceuticalCo.，Ltd.，Baoding,Hebei, 071000，China)

To investigate the effects of the extract of radix rehmanniae on nonspecific immunological function in chicks, 1 day old chicks fed with basal diet until 14 day old were randomly divided into 6 groups to get different treats: extracts of radix rehmanniae additive groups ( 1，2，3 g/L added in basal diet respectively in group Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ and inactivated H9 influenza vaccine at 14 day-old) .Astragaluspolysaccharidesadditive group (0.4‰ added in basal diet in group Ⅳ and inactivated H9 influenza vaccine at 14 day-old), basal diet group (group Ⅴinactivated H9 influenza vaccine at 14 day-old), and blank group (no vaccination and fed with basal diet ), their diets returned to basal diet 7 days later, and the blood samples were collected from all chicks at 14，21，28，35，42，49，56 day old to detect white cell counts, lysozyme, IFN-α and TFN-α contents. Results showed that during the 7 week sampling, compared with bank group, addtion ofAstragaluspolysaccharidesand extracts of radix rehmanniae promoted the chick white cell proliferation in different extents and increased the contents of lysozyme, IFN-α and TNF-α(P<0.05). The white cell counts in additive groups (groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ) were significantly higher than that in blank group (P<0.05), while no obvious difference was observed between group Ⅱand Ⅳ (P>0.05); at 35 day old, the white cell counts were higher in goup Ⅱand group Ⅳ, and lysozyme and TNF-α contents of low dose group chick were significantly increased (P<0.05) ; at the day of 14-28，IFN-α contents in radix rehmanniae extract groups (group Ⅱand Ⅲ) showed no significant difference compared withAstragaluspolysaccharidesadditive group (P>0.05), while showed great difference compared with blank group(P<0.05) . In conclusion, the extract of radix rehmanniae bears the ability of enhancing chick nonspecific immunological function, can be used as a new type of immunopotentiator and is suggested to add 2 g/L in chick basal diet.

chicks; rehmannia;Astragaluspolysaccharide; nonspecific immunity; H9 subtype influenza vaccine

2016-01-14

河北省现代农业产业技术体系蛋鸡产业创新团队专项资金资助项目

刘昭(1990-)，女，河北定州人，硕士研究生，主要从事新兽药研发与药物残留研究。*通讯作者

S853.75

A

1007-5038(2016)08-0036-05