UPLC法同时测定胃苏颗粒中4种成分的含量

郭殷锐，张广唱，王　剑（广州中医药大学基础医学院，广州　510006）

UPLC法同时测定胃苏颗粒中4种成分的含量

郭殷锐＊，张广唱，王剑#（广州中医药大学基础医学院，广州510006）

目的：建立同时测定胃苏颗粒中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的方法。方法：采用超高效液相色谱法。色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，流动相为乙腈-0.2%磷酸（梯度洗脱），流速为0.40 ml/min，检测波长为284 nm，柱温为30℃，进样量为1 μl。结果：芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的检测质量浓度线性范围分别为9.38～93.75 μg/ml（r=0.999 7）、32.25～322.50 μg/ml（r=0.999 7）、11.25～112.50 μg/ml（r=0.999 9）、11.88～118.75 μg/ml（r=0.999 8）；定量限分别为20、18、18、18 ng，检测限分别为6、5、5、5 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率分别为96.24%～103.12%（RSD= 2.45%，n=6）、98.43%～102.10%（RSD=1.42%，n=6）、96.10%～101.41%（RSD=2.07%，n=6）、95.57%～99.06%（RSD= 1.44%，n=6）。结论：该方法快速、高效，适用于同时测定胃苏颗粒中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量。

超高效液相色谱法；胃苏颗粒；芸香柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷；柚皮苷；含量测定

胃苏颗粒为紫苏梗、香附、陈皮、香橼、佛手、枳壳、槟榔、炒鸡内金8味药材组合而成的复方制剂，具有理气消胀、和胃止痛的功效，主治气滞型胃脘痛、慢性胃炎及消化性溃疡［1-3］。查阅相关文献［4-6］，对于胃苏颗粒质量控制的研究，目前仅见高效液相色谱（HPLC）法对其中柚皮芸香苷、柚皮苷等成分的含量测定报道，未见采用超高效液相色谱（UPLC）法的相关报道。UPLC法作为一种新型液相色谱技术，相比传统HPLC，具有分离能力强、分析速度快、灵敏度高的特点［7-8］。因此，笔者开展本项研究，旨在利用UPLC法建立一种快速、准确、有效测定胃苏颗粒中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的方法，为其质量控制提供参考。

1　材料

1.1仪器

ACQUITY型UPLC仪，包括QSM四元溶剂管理器、二极管阵列（PDA）检测器、SM-FTN样品管理器、CH-A型柱温箱、Empower3色谱工作站（美国Waters公司）；BP211D型十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；KQ-100DE型超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司，功率：100 W，频率：40 kHz）。

1.2药品与试剂

胃苏颗粒（扬子江药业集团有限公司，批号：13122301、14021403、14022701、14080902、14101002、14102801、15011202、15022301，规格：5 g/袋）；芸香柚皮苷对照品（批号：MUST-12040812，纯度≥98.0%）、橙皮苷对照品（批号：MUST-11030701，纯度≥98.0%）、新橙皮苷对照品（批号：MUST-12030914，纯度≥98.0%）、柚皮苷对照品（批号：MUST-12040812，纯度≥98.0%）均购自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脱（0 min，16% A；6 min，35%A）；流速：0.40 ml/min；检测波长：284 nm；柱温：30℃；进样量：1 μl。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液取芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷对照品各适量，精密称定，置于同一25 ml量瓶中，用80%乙醇溶解并定容，制成每1 ml含芸香柚皮苷93.75 μg、柚皮苷322.50 μg、橙皮苷112.50 μg、新橙皮苷118.75 μg的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液取样品约0.5 g，精密称定，置于50 ml具塞锥形瓶中，加80%乙醇40 ml，浸泡30 min，超声提取30 min，称定质量，用80%乙醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液［4］按胃苏颗粒的处方比例和制备工艺，制备缺陈皮、枳壳、香橼和佛手的阴性对照品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液，即得。

2.3系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，各成分均能达到基线分离，分离度均＞1.5，理论板数以柚皮苷峰计≥13 000；柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷保留时间分别为4.485、4.773、4.987、5.266 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图1　超高效液相色谱图A.阴性对照；B.混合对照品；C.供试品；1.芸香柚皮苷；2.柚皮苷；3.橙皮苷；4.新橙皮苷Fig 1　UPLC chromatogramsA.negative control；B.mixed reference substance；C.test sample；1/narirutin；2.naringin；3.hesperidin；4.neohesperidin

2.4线性关系考察

精密量取“2.2.2”项下混合对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 ml，分别置于5 ml量瓶中，用80%乙醇定容，摇匀，得系列线性溶液。取上述溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的回归方程与线性范围，详见表1。

表1　回归方程与线性范围Tab 1　Regression equations and linear ranges

2.5定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得定量限（LOQ）；当信噪比为3∶1时，得检测限（LOD），详见表2。

表2　定量限与检测限Tab 2　Quantitation limit and detection limit

2.6精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，柚皮芸香苷、橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷峰面积的RSD分别为1.54%、0.89%、1.05%、1.10%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7稳定性试验

取同一供试品溶液（批号：13122301）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、16、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷峰面积的RSD分别为1.27%、1.18%、1.59%、0.84%（n=6），表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.8重复性试验

取同一批样品（批号：13122301）6份，每份约0.50 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各成分的平均含量，详见表3。

表3　重复性试验结果Tab 3　Result of reproducibility tests

2.9加样回收率试验

取已知含量样品（批号：13122301）适量，共6份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷柚皮苷对照品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表4。

2.10样品含量测定

取8批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各成分的含量，结果见表5。

3　讨论

3.1提取方法与溶剂的选择

试验中考察了超声提取法与加热回流提取法提取待测成分的差异。结果，超声处理30 min与加热回流1 h，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的提取率无显著性差异，考虑超声提取法简便易行，本试验选择超声提取法。同时，还考察了不同体积分数（0、20%、40%、60%、80%、100%）甲醇、乙醇超声提取对4种待测成分提取率的影响。结果，以80%乙醇作为提取溶剂时对4种待测成分的提取最为完全，且提取液易于过滤。故本试验采用80%乙醇作为提取溶剂。

表4　加样回收率试验结果（n=6）Tab 4　Results of recovery tests（n=6）

表5　样品含量测定结果（n=3，mg/g）Tab 5　Result of contents determination of samples（n=3，mg/g）

3.2检测波长的选择

对混合对照品溶液和供试品溶液均采用PDA检测器进行紫外全波长扫描（200～400 nm）。结果，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷色谱峰在284 nm处均有最大吸收，并参照相关文献［9-11］，本试验最终选择284 nm为检测波长。

3.3流动相的选择

本试验考察了甲醇-0.1%/0.2%磷酸、甲醇-0.5%/1.0%醋酸、乙腈-0.1%/0.2%磷酸、乙腈-0.5%/1.0%醋酸等不同流动相系统。结果，乙腈-0.2%磷酸效果最好，基线最为平稳，分析时间短，各待测成分分离度高、峰型较好，且液相系统压力低。故最终选用乙腈-0.2%磷酸作为本试验的流动相。

3.4样品含量测定结果分析

对8批胃苏颗粒中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷进行含量测定。结果表明，芸香柚皮苷含量为1.019 0～1.552 4 mg/g，平均含量为1.256 8 mg/g；柚皮苷含量为5.864 2～7.644 2 mg/g，平均含量为6.596 6 mg/g；橙皮苷含量为2.785 4～3.481 4 mg/g，平均含量为3.125 5 mg/g；新橙皮苷含量为2.876 4～4.332 8 mg/g，平均含量为3.629 9 mg/g。可见，8批样品间4种成分含量存在一定差异，可能与批次跨度较大、生产原料质量存在一定差异有关，但总体来说8批样品中4种成分的含量与均值差值较小，较为稳定。

综上所述，本方法快速、高效，适用于同时测定胃苏颗粒中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：1 171.

［2］杨佳静，薛佳，周华方，等.HPLC法同时测定胃苏颗粒中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量［J］.中国药房，2014，25（4）：372.

［3］赵沈娟，黄新兰，石晶萍，等.胃苏颗粒的质量标准研究［J］.中国药事，2009，23（1）：70.

［4］李玲，赵顺，罗疆南，等.一测多评法测定胃苏颗粒中4种成分的含量［J］.药物分析杂志，2015，35（4）：751.

［5］李沁媛，唐亚琴，徐辉，等.高效液相色谱法测定胃苏颗粒中橙皮苷和柚皮苷含量［J］.西南科技大学学报，2011，26 （2）：82.

［6］葛晓磊，张欣，李伟欣，等.RP-HPLC同时测定胃苏颗粒中间体中3种黄酮苷的含量［J］.食品与药品，2016，18 （2）：112.

［7］李化，刘静，董红敬，等.HPLC法与UPLC法同时测定黄芩中5种黄酮类成分含量的比较［J］.中国药房，2014，25 （35）：3 293.

［8］陈佳，王钢力，姚令文，等.超高效液相色谱（UPLC）在药物分析领域中的应用［J］.药物分析杂志，2008，28（11）：1 976.

［9］朱露，雷鹏，黄琪，等.反相高效液相色谱法测定枳实中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量［J］.中南药学，2013（12）：934.

［10］王元清，严建业，师白梅，等.不同批次枳壳中柚皮苷、新橙皮苷、总黄酮、挥发油的含量比较及质量评价［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（7）：146.

［11］宋剑锋，冯敬骞，胡建华，等.HPLC法同时测定常山胡柚花中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的量［J］.中草药，2014，45（6）：854.

（编辑：刘柳）

Simultaneous Determination of Four Components in Weisu Granule by UPLC

GUO Yinrui，ZHANG Guangchang，WANG Jian（College of Basic Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of narirutin，naringin，hesperiden and neohesperiden in Weisu granule.METHODS：UPLC was performed on the column of ACQUITY UPLC BEH C18with mobile phase of acetonitrile-0.2%Phosphoric acid aqueous（gradient elution）at a flow rate of 0.40 ml/min，the detection wavelength was 284 nm，the column temperature was 30℃，and the injection volume was 1 μl.RESULTS：The linear range was 9.38-93.75 μg/ml for narirutin（r=0.999 7），32.25-322.50 μ g/ml for naringin（r=0.999 7），11.25-112.50 μ g/ml for hesperiden（r=0.999 9）and 11.88-118.75 μg/ml for neohesperidin（r=0.999 8）；limits of quantitation were 20 ng，18 ng，18 ng and 18 ng，the limits of detection were 6 ng，5 ng，5 ng and 5 ng，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 96.24%-103.12%（RSD=2.45%，n=6），98.43%-102.10%（RSD=1.42%，n=6），96.10%-101.41%（RSD= 2.07%，n=6）and 95.57%-99.06%（RSD=1.44%，n=6），respectively.CONCLUSIONS：The method is rapid and efficient，and suitable for the simultaneous determination of narirutin，naringin，hesperiden and neohesperiden in Weisu granule.

UPLC；Weisu granule；Narirutin；Hesperiden；Neohesperidin；Naringin；Content determination

R927.2文献标志码A

1001-0408（2016）24-3443-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.41

＊硕士研究生。研究方向：中医药延缓衰老、中草药成分。电话：020-39358637。E-mail：75706868@qq.com

教授，博士。研究方向：中医药延缓衰老、中草药成分。E-mail：zswj@gzucm.edu.cn

2015-07-30

2016-05-16）