泡菜中优良乳酸菌筛选及特性的研究

李 静，王 瑶，邓毛程（广东轻工职业技术学院，广东广州510300）

泡菜中优良乳酸菌筛选及特性的研究

李 静，王 瑶，邓毛程*
（广东轻工职业技术学院，广东广州510300）

为了获得适用于纯种强化发酵泡菜生产的优良菌种，采用平板筛选法和发酵筛选法从泡菜中分离、筛选乳酸菌，采用形态、生理生化和16S rDNA等特性的分析技术对优选菌种进行鉴定，并通过发酵实验进一步研究优选菌种的发酵特性。经筛选，获得一株乳酸产量最高的菌种LP-09，该菌种被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。发酵实验结果表明，菌种LP-09的最适温度和初始pH分别为37℃和6.0，具有较强的耐盐性，在含有40 g/L NaCl的培养基中生长正常，在含有100 g/L NaCl的培养基中可缓慢发酵产酸；同时，菌种LP-09具有较强的亚硝酸盐降解能力，对200 mg/L亚硝酸盐的降解率可达99.3%以上。

植物乳杆菌，筛选，耐盐，亚硝酸盐

泡菜具有美味、爽口、开胃等特点，是我国已有三千多年历史的传统发酵食品［1］。乳酸菌是泡菜制作过程中的优势微生物，对泡菜品质具有重要影响［2］。随着对食品安全要求的提高，我国传统泡菜行业正朝着生产工业化和产品标准化的方向而发展，乳酸菌强化发酵技术已成为了改良传统泡菜的重要手段［3］。

优良乳酸菌是实现纯种强化发酵泡菜的前提，多年来人们一直致力于优良乳酸菌筛选的研究工作。通过对泡菜中微生物的分离与鉴定，乳杆菌属（lactobacillus）和明串珠菌属（Leuconostoc）被确认为泡菜发酵的优势菌群［2-4］。研究人员已从泡菜中获得一些具有较强产酸和耐盐性能的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）、短乳杆菌（lactobacillus brevis）、副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）和戊糖乳杆菌（lactobacillus pentose）等［5-6］，同时也发现一些植物乳杆菌降解亚硝酸盐的能力较强［7-8］。泡菜发酵对乳酸菌的产酸、耐盐和降亚硝酸盐等性能均有要求，由于传统泡菜发酵通常由混合菌群协同完成，尽管现已分离出不少优良乳酸菌，但单一菌种较难同时满足几方面性能的要求，使纯种强化发酵泡菜的实施受到一定的限制。本实验从泡菜中筛选乳酸菌，以期获得兼有产酸、耐盐和降亚硝酸盐等方面良好性能的优良菌种，并初步研究菌种的特性，为泡菜工业化生产提供有益的帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

泡菜 购于广东省雷州市菜市场；乳酸 色谱纯；葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、松三糖、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸三铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、Tween-80 分析纯；酪蛋白胨、牛肉粉、酵母粉 市售生化试剂；MRS培养基 酪蛋白胨10.0 g，牛肉粉8.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，硫酸镁0.2 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸三铵2.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸锰0.05 g，吐温1.0 g，蒸馏水1000 mL，pH6.2±0.2。

FA2204型电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；JA5003型精密电子天平 杭州中拓仪器有限公司；YX-280D型蒸汽灭菌器 合肥华泰医疗设备有限公司；SW-CJ-2FD型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；SPX-100-Z型生化培养箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂；A200型基因扩增仪 杭州朗基科学仪器有限公司；RDY-SP1Z型核酸电泳仪 北京荣阳经典科技有限公司；GI-1型凝胶成像系统 通宝达成科技（北京）有限公司；S-3000N型扫描电镜 日本日立公司；H-7650型透射电镜 日本日立公司；Essentia LC-15C型高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.2 乳酸菌的筛选

采用含有15 g/L CaCO3的MRS琼脂培养基制作分离平板，将泡菜汁进行梯度稀释，涂布于平板上，置于37℃下培养36～48 h，挑取周围有明显透明圈的单菌落，再在无菌的分离平板上进行划线分离，然后将纯化后的单菌落挑取至斜面，培养后保藏备用。将各菌株的斜面菌种分别接入含有20 g/L葡萄糖的MRS培养基中，置于37℃下培养48 h，采用液相色谱法分析发酵液中的乳酸产量，优选乳酸产量最高的菌株进行进一步的研究。

1.3 乳酸菌的鉴定

分别利用普通光学显微镜、扫描电镜和投射电镜对优选菌种的菌体进行观察。按照《Bergy's Manual of Determinative for Bacteriology》中生理生化分析方法［9］，对菌种进行过氧化氢酶实验、吲哚实验、甲基红实验、硝酸盐还原实验、淀粉水解实验、明胶液化实验以及各种糖类利用实验。参照文献的16S rDNA鉴定方法［10］，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′）对16S rDNA进行扩增，纯化后PCR产物的序列检测由深圳华大基因公司完成，在NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）中检索序列的同源性，并采用Neighborjoining法构建系统发育树。

1.4 温度对生长的影响

调节MRS培养基的pH至6.0，将100 mL培养基装入三角瓶，接入1环斜面菌种，分别置于28、31、34、 37、40℃下进行培养24 h。在培养过程中，每隔4 h取样进行梯度稀释，涂布于平板培养基上，培养后进行菌落计数。根据菌落计数结果，选择最佳的培养温度。

1.5 pH对生长的影响

将MRS培养基调节至pH5.0、5.5、6.0和6.5，接入斜面菌种后，置于最佳的温度下培养24 h。在培养过程中，每隔4 h采用平板菌落计数法测定培养液的菌体数，从而选择最佳的初始pH。

1.6 盐度对乳酸生成的影响

在含有10 g/L葡萄糖的MRS培养基中，分别添加0、20、40、60、80、100 g/L的氯化钠，调节至最佳的初始pH，接入斜面菌种，在最佳的温度下培养144 h，取培养72、144 h的培养液进行乳酸含量测定。

1.7 菌种对亚硝酸盐的降解实验

为了检验菌种降解亚硝酸盐的能力，在含有20 g/L葡萄糖的MRS培养基中添加200 mg/L的亚硝酸钠，调节至最佳的初始pH，接入斜面菌种，在最佳的温度下进行培养，每隔8 h取样检测残留的亚硝酸盐，并计算亚硝酸盐的降解率，如下式：

降解率（%）=（降解前亚硝酸盐含量-降解后亚硝酸盐含量）/降解前亚硝酸盐含量×100

1.8 乳酸的测定

测定前，培养液经离心去除菌体，再经适当稀释，过0.45 μm滤膜，所得滤液作为待测溶液。采用日本岛津高效液相色谱仪测定乳酸，参照文献的液相色谱条件［11］：色谱柱为Hypersil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为甲醇与0.01 mol/L磷酸二氢钾的混合溶液（3∶97，v/v），用磷酸调节pH2.0；流速为0.5 mL/min；进样量为5 μL；柱温为30℃；检测波长为210 nm。将乳酸标准品配制成10 mg/mL的乳酸标准液，用流动相稀释成不同浓度，进行高效液相色谱分析，以乳酸浓度（mg/mL）为横坐标，以峰面积（mAU）为纵坐标，建立线性回归方程。培养液的稀释样品测定后，根据线性回归方程计算出稀释样品中的乳酸含量，培养液的乳酸产量即为：稀释样品中乳酸含量×稀释倍数。

1.9 亚硝酸盐的测定

按照GB 5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的操作方法进行测定［12］。

2 结果与讨论

2.1 优良菌种的筛选

从MRS平板上挑取30株具有溶钙圈的菌株，初步视为产酸菌。将这些菌株分别进行发酵，采用高效液相色谱对发酵产物进行分析，与乳酸标准品的色谱图对比，从保留时间（4.916 min）可以确定30株菌的主要产物均为乳酸。通过建立乳酸外标曲线，发现乳酸浓度为1～5 mg/mL时的线性关系良好，其回归方程为y=304996.18x+10785.94（其中：y为峰面积，mAU；x为乳酸浓度，mg/mL），相关系数r=0.9992。根据回归方程对各菌株48 h的乳酸产量进行计算，结果表明，乳酸产量低于5.5 g/L的菌株有24株，高于8.0 g/L的菌株有6株，其中产量较高6株菌的乳酸产量如图1所示。菌种LP-09的乳酸产量最高，故选其为进一步研究的菌种。

图1 优良菌种的乳酸产量Fig.1 Yield of lactic acid produced from 6 potential strains

2.2 菌种的鉴定

菌种LP-09经革兰氏试剂染色和显微镜观察，呈阳性，菌体形态为杆状。在扫描电镜（10 k×）、透射电镜（10 k×）下观察，电镜图像如图2所示，菌体无鞭毛，大小约为（1.0～2.2）μm×（0.6～0.8）μm。获得菌种LP-09的16S rDNA序列为1438 bp，经同源性检索，发现其与许多植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的同源性达99%以上。采用MEGA5.1软件以Neighborjoining法构建系统发育树，如图3所示，菌种LP-09与Lactobacillus plantarum S2S21（登录号：KP345897.1）的亲缘关系最近。通过生理生化实验，菌种LP-09的主要生理生化特征如表1所示。综合16S rDNA鉴定和生理生化鉴定的结果，可确定菌种LP-09为植物乳杆菌。

图2 在扫描电镜和透射电镜下的图像Fig.2 SEM（10 k×）and TEM（10 k×）photographs of cell morphology of strain LP-09

图3 菌种LP-09的系统进化树Fig.3 The sequence phylogenetic tree of strain LP-09

表1 菌株LP-09的生理生化特征Table1 Physiological and biochemical characteristics of strain LP-09

2.3 温度对菌种生长的影响

在不同温度下，菌种LP-09的生长情况如图4所示。从图4中可以看出，在各实验温度下，培养4 h后的菌种均可进入对数生长期。从生长速度来看，34～40℃的温度范围较适宜菌体生长。其中，在37℃下进行培养，菌种生长速度最快，16 h开始进入生长稳定期，此时的菌落数达到最大值，故该温度被确认为最佳生长温度。

图4 不同温度下的生长情况Fig.4 Growth status of strain under different temperature

2.4 pH对菌种生长的影响

图5 不同pH下的生长情况Fig.5 Growth status of strain under different pH

在不同初始pH下，菌种LP-09的生长情况如图5所示。乳酸菌生长有其最适宜的pH范围，但在培养过程不控制pH的情况下，乳酸的分泌将会引起pH降低，从而对乳酸菌的生长和生理活动产生影响，因而控制初始pH对菌种生长具有重要作用。在实验的范围内，初始pH为6.0～6.5时的生长速度较快，表明此初始pH范围适宜于菌种生长。其中，初始pH为6.0时的菌落数最大，达到生长稳定期时间最快，故确定最佳的初始pH为6.0。从适宜生长的初始pH来看，菌种LP-09与其他植物乳杆菌是一致的［5，13］。

2.5 盐度对乳酸生成的影响

在含有不同浓度NaCl的MRS培养基中，菌种LP-09产乳酸情况如图6所示。在0～40 g/L的NaCl浓度范围，盐度对菌种影响不大，各盐度下的乳酸产量变化不大，且在40 g/L的NaCl浓度下，72 h和144 h的乳酸产量十分接近，分别为11.25 g/L和11.89 g/L，表明菌种在72 h左右基本可以完成产酸作用。当NaCl浓度达到60 g/L或以上时，72 h和144 h的乳酸产量均有明显的下降；且随着NaCl浓度增大，72 h和144 h的乳酸产量差距趋于明显，表明高盐度对菌种产生一定的抑制作用，菌体生长和乳酸分泌较为缓慢，需要较长时间完成乳酸的积累。根据文献报道［5-6］，在80 g/L以上NaCl浓度下，一些耐盐性的植物乳杆菌生长或产酸都比较微弱。在100 g/L的NaCl浓度下，菌种LP-09 在144 h仍可产乳酸2.39 g/L，具有一定的耐盐性，在高盐培养基中可进行缓慢发酵。

2.6 亚硝酸盐的降解

在含有200 mg/L NaNO2的MRS培养基中，菌种LP-09降解亚硝酸盐的情况如图7所示。亚硝酸盐降解率随着发酵时间延长而增大，其中8 h以后的增大幅度较大，至40 h达到99.3%，而后变化趋于平缓。根据文献报道，一些植物乳杆菌对150 mg/L NaNO2的降解率为96%～98%［7-8］，相对而言，菌种LP-09具有较强的降亚硝酸盐能力。在文献所报道的泡菜发酵过程中，所产生的亚硝酸盐峰值一般不超过40 mg/kg［14-15］。因此，如果菌种LP-09应用发酵蔬菜生产，可以有效地控制泡菜的亚硝酸盐含量。

图7 不同时间的亚硝酸盐降解率Fig.7 Time course of degradation rate of LP-09 acted on nitrate

3 结论

从泡菜中筛选获得30株乳酸产生菌，经发酵实验和对乳酸产物进行定量，优选出乳酸产量最高的菌种LP-09。通过对形态、生理生化特性和16S rDNA序列进行分析，菌种LP-09被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。植物乳杆菌LP-09生长的最适温度和初始pH分别为37℃和6.0。具有较强的耐盐性，在含有40 g/L NaCl培养基中进行培养，72 h的乳酸产量达11.25 g/L；同时，在含有100 g/L NaCl培养基中仍可缓慢发酵产酸，144 h的乳酸产量达2.39 g/L。另外，植物乳杆菌LP-09具有很强的亚硝酸盐降解能力，对200 mg/L亚硝酸盐的降解率可达99.3%以上。因此，植物乳杆菌LP-09是一株具有应用潜力的菌株。但是，仍需对其进行泡菜发酵实验，进一步掌握菌种发酵特性和优化发酵工艺条件，以推动该菌种在泡菜工业化生产中的应用。

［1］陈功，夏有书，张其圣，等.从中国泡菜看四川泡菜及泡菜坛［J］.中国酿造，2010，8：5-8.

［2］徐丹萍，蒲彪，敖晓琳，等.传统泡菜中乳酸菌的研究现状［J］.食品工业科技，2013，34（19）：369-373.

［3］陈其钢，温明显.利用乳酸菌生产传统发酵食品研究进展［J］.农产品加工（学刊），2013，329（9）：48-51.

［4］陈功，张其圣，余文华，等.四川泡菜乳酸菌多样性及其功能特性［J］.食品与发酵工业，2013，39（3）：1-4.

［5］王笋，吕嘉枥，辛博，等.西北地区泡菜中乳酸杆菌的生物学特性［J］.中国调味品，2014，39（3）：15-18.

［6］黎尔纳，林海燕，邓开野.泡菜中植物乳杆菌的分离及其发酵特性的研究［J］.仲恺农业工程学院学报，2012，25（3）：26-29.

［7］陈中，林浩，林伟锋.植物乳杆菌在自制培养基中降解亚硝酸盐的研究［J］.现代食品科技，2014，30（3）：53-57.

［8］黄超，迟原龙，黄紫霖，等.植物乳杆菌AB-1降解亚硝酸钠的条件优化［J］.中国酿造，2014，33（9）：13-16.

［9］Holt SG，Kriey NR，Sneath PHA，et al.Bergy's Manual of Determinative for Bacteriology［M］.New York：Williams and Wilkins，1998.

［10］邓毛程，王瑶，李静，等.细菌纤维素产生菌的筛选、鉴定及其产物分析［J］.河南工业大学学报：自然科学版，2014，35（5）：88-92.

［11］周萍，罗梁华，胡福良.高效液相色谱法测定食醋及醋粉中的醋酸和乳酸［J］.中国调味品，2008，7：84-86.

［12］GB 5009.33-2010食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定［S］.

［13］赵巍，付丽，王欣，等.不同发酵条件对植物乳杆菌生长的影响［J］.饲料工业，2014，35（22）：44-47.

［14］汪立平，汪欣，艾连中，等.纯种植物乳杆菌发酵低盐萝卜泡菜的研究［J］.食品科学，2013，34（17）：182-186.

［15］袁亚，池金颖，黄丹丹，等.人工接种乳酸菌对泡菜感官品质和亚硝酸盐含量的影响［J］.食品工业科技，2012，33（7）：119-123.

Screening and characterization of an excellent Lactobacillus isolated from pickle

LI Jing，WANG Yao，DENG Mao-cheng*
（Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300）

To obtain excellent and pure breed strain suitable for producing fermented vegetable products，strains were isolated，screened from pickle using plate screening as well as fermentation screening method.And then，optimizing species were identified using morphological，physiological and biochemical properties and 16S rDNA analysis technology.Finally，further study on fermentation characteristics of the target strain carried out a series of fermentation test.A strain named LP-09，with maximum lactic acid-producing，was isolated from pickle and identified as Lactobacillus plantarum.Results of fermentation tests showed that the optimal temperature and initial pH suitable for strain LP-09 were 37℃ and 6.0，respectively.Meanwhile，the strain owned better salt tolerance because it could grow normally in culture media with 40 g/L NaCl，or could keep fermenting and producing lactic acid even at 100 g/L NaCl concentration continuously and slowly.At the same time，strain LP-09 possessed quite strong ability to degrade nitrite and degradation rate of 200 mg/L nitrite could reach more than 99.3%.

lactobacillus plantarum；screen；salt tolerance；nitrite

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0229-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.039

2015－07－21

李静（1974-），女，博士研究生，副教授，研究方向：环境科学、资源综合利用技术，E-mail：eeslee2005@163.com。

邓毛程（1971－），男，博士，教授，研究方向：生物工程，E-mail：dengmc@163.com。

湛江市科技计划项目（2014A03001）；创新强校工程专项资金自主创新能力提升项目（1A10205，1A20105）；创新强校工程专项资金机制改革与协同创新项目（1A20201）。