红松松仁膜衣提取物体外抗氧化活性研究

张晓茹，李 星，王 彬，王增凯，徐红艳，*（.延边大学农学院，吉林延吉3300；.延吉秀爱食品有限公司，吉林延吉33000）

红松松仁膜衣提取物体外抗氧化活性研究

张晓茹1，李 星2，王 彬2，王增凯1，徐红艳1，*
（1.延边大学农学院，吉林延吉133002；2.延吉秀爱食品有限公司，吉林延吉133000）

本文旨在探明长白山红松松仁膜衣提取物的体外抗氧化活性。分别采用60%乙醇和50%丙酮为提取剂，提取物冻干后，用分光光度法测其总多酚和总黄酮纯度，研究其自由基清除能力和还原铁离子的能力。结果表明，松仁膜衣乙醇提取物总多酚纯度为39.02%，总黄酮纯度为10.19%；丙酮提取物总多酚纯度为44.09%，总黄酮纯度为14.59%。红松松仁膜衣提取物清除ABTS+·、DPPH·、羟自由基（·OH）的能力和还原铁离子能力都呈现一定的剂量效应关系，且对DPPH·的清除作用和还原铁离子能力强于BHT；丙酮提取物对ABTS+·和·OH的清除能力显著高于乙醇提取物，表明丙酮提取物的抗氧化能力强于乙醇提取物。同时，在实验范围内，红松松仁膜衣提取物的抗氧化能力与其总多酚、总黄酮的纯度存在正相关性。

红松，松仁膜衣，抗氧化

红松（Pinus koraiensis），常绿乔木，又名海松、果松、朝鲜松，在我国主要分布在长白山到小兴安岭一带，常与鱼鳞松、臭松、椴树、桦树等形成混交林［1］，是东北地区重要的林业资源。红松松仁富含营养物质［2］，具有多种生物活性［3］，自古就是食疗佳品。红松松仁膜衣为松科植物红松松仁外的薄皮，在松仁生产加工过程中，会脱去松仁膜衣，从而产生大量的膜衣废弃物。目前我国红松松仁膜衣未得到利用，营养成分特别是生物活性成分及功能作用的相关研究也未见报道。而俄罗斯产松仁膜衣中含蛋白质、脂类、纤维素等营养成分，乙醇浸提物可达10%左右［4］，且已在焙烤食品中得到应用［5］。

酚类化合物和黄酮类化合物都是植物的次生代谢产物，在自然界中储量丰富。多酚类化合物是一种良好的抗氧化剂［6］，黄酮类化合物结构中的酚羟基可作为氢供体还原自由基，会终止或减少自由基链式反应的发生［7-8］。研究发现，多酚类化合物和黄酮化合物具有的保护心脑血管系统、抗肿瘤、抗病毒以及抗炎抑菌等多种生物活性均与其抗氧化活性密切相关［9-10］。

本研究以加工红松松仁产生的废弃物即松仁膜衣为原料，经乙醇、丙酮提取及真空冷冻干燥，制得提取物冻干粉，采用分光光度法测定总多酚和总黄酮纯度，并通过建立多个氧化反应体系，对其体外抗氧化活性进行研究，旨在为红松松仁膜衣活性成分的深入研究及其综合开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红松松仁膜衣 由延吉秀爱食品有限公司提供；芦丁标准品 中国药品生物制品检定所；ABTS ［2，2′-连氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）］、DPPH ［2，2-二（4-叔辛基苯基）-1-苦肼基）］、BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚） Sigma公司；VC国药集团化学试剂有限公司；其他试剂 均为分析纯。

U-3900型紫外可见分光光度计 日本日立公司；N-1001旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；FA1104型分析天平 上海天平仪器厂；LGJ-18A真空冷冻干燥机 北京四环科学仪器有限公司；5804R离心机 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 红松松仁膜衣→粉碎→溶剂提取→减压浓缩→真空冷冻干燥→松仁膜衣提取物。

1.2.2 松仁膜衣提取物的制备

1.2.2.1 乙醇提取法 参考徐红艳等［11］的方法，松仁膜衣粉末用60%乙醇提取，料液比为1∶20，60℃水浴5 h，抽滤，提取液减压浓缩，-40℃、40 Pa、24 h真空冷冻干燥，得到乙醇提取物冻干粉。

1.2.2.2 丙酮提取法 参考汤务霞等［12］的方法，松仁膜衣粉末用50%丙酮提取，料液比为1∶10，室温冷浸24 h，抽滤，提取液减压浓缩，-40℃、40 Pa、24 h真空冷冻干燥，得到丙酮提取物冻干粉。

1.2.3 松仁膜衣提取物纯度的测定

1.2.3.1 松仁膜衣提取物中总多酚纯度的测定 参考李波等［13］的方法，精确称取没食子酸标准品100 mg，加蒸馏水溶解并定容于100 mL容量瓶中，得浓度为1 mg/mL的标准品溶液。分别向7只10 mL容量瓶中加入1 mg/mL的标准品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL，加蒸馏水至刻度，分别配制成浓度为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24 mg/mL的没食子酸溶液。各吸取1 mL溶液于25 mL容量瓶中，分别加入福林酚试剂2 mL，充分振荡后静置4 min，加入10%碳酸钠溶液10 mL，蒸馏水定容，50℃水浴1 h，测定765 nm处的吸光值。以没食子酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

称取一定量的冻干粉并复溶，按上述方法测定总多酚的浓度，冻干粉的多酚纯度计算公式如下：

式中，V为冻干粉复溶后溶液的体积（mL）；N为稀释倍数；C为按标准曲线计算的复溶溶液的总多酚浓度；m为冻干粉的质量（mg）。

1.2.3.2 松仁膜衣提取物中总黄酮纯度的测定 采用NaNO2-Al（NO3）3比色法［14］。精密称取芦丁对照品20 mg，用少量60%乙醇溶解后，转移至100 mL容量瓶，定容至刻度线。分别精密量取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL芦丁溶液置于试管中，加入5%的亚硝酸钠溶液0.5 mL，摇匀，静置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀，静置6 min，加入4%的氢氧化钠溶液5 mL，摇匀，加入60%乙醇定容至10 mL，静置25 min，在509 nm波长处测定吸光值，以芦丁浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

称取一定量的冻干粉并复溶，按上述方法测黄酮的浓度，冻干粉黄酮的纯度计算公式如下：

式中，V为冻干粉复溶后溶液的体积（mL）；N为稀释倍数；C为按标准曲线计算的复溶溶液的总黄酮浓度；m为冻干粉的质量（mg）。

1.2.4 松仁膜衣提取物体外抗氧化活性测定

1.2.4.1 对ABTS+·清除活性测定 在乙醇提取物和丙酮提取物均为10、20、40、80、160 μg/mL，VC10、20、30、40、50 μg/mL，BHT 1、5、25、125 μg/mL时对其ABTS+·清除活性进行测定。参照Werf等［15］的方法，略作修改。将2.6 mmol/L的过硫酸钾溶液50 mL与7.4 mmol/L的ABTS溶液50 mL混合后于室温避光静置24 h，配成ABTS储备液，后4℃避光储存备用。现用时稀释，使其在734 nm波长下吸光值为0.700±0.020即为ABTS工作液。

取ABTS工作液3.8 mL，加入样品溶液0.2 mL，室温下避光放置10 min，在734 nm波长下测A1，以蒸馏水代替ABTS工作液的吸光度为A2，以60%乙醇代替样品溶液的吸光度为A0。按如下公式计算清除率：

1.2.4.2 对DPPH·清除活性测定 在乙醇提取物和丙酮提取物均为0.25、0.5、1、2、4 mg/mL，VC1、2、10、20、40、80 μg/mL，BHT 5、10、20、40、60、80 μg/mL时对DPPH·清除活性进行测定。方法在文献［16］的基础上略作修改。配制0.15 mmol/L的DPPH储备液，4℃避光储存。现用时稀释，使其在517 nm波长下吸光值为0.700±0.020即为DPPH工作液。

取DPPH工作液2 mL，加入样品溶液2 mL，室温下避光放置30 min，在517 nm波长下测A1，以无水乙醇代替DPPH工作液的吸光度为A2，以60%乙醇代替样品溶液的吸光度为A0。按公式（3）计算清除率。

1.2.4.3 对·OH清除活性测定 由于测定·OH的反应体系为水溶性体系，将脂溶性的BHT溶液加入反应体系时生成不溶物，因此测定·OH清除活性中，没有以BHT为对照。在乙醇提取物和丙酮提取物均为250、500、1000、2000、4000 μg/mL，VC为50、100、200、400、800 μg/mL时对·OH清除活性进行测定。

采用Fenton反应产生·OH［17］。羟基自由基氧化水杨酸产生的2，3-二羟基苯甲酸，其在510 nm有特征吸收，从而可以通过检测反应体系中2，3-二羟基苯甲酸的生成量，检测残留的羟自由基，进而测定红松松仁膜衣提取物对羟基自由基的清除作用。

取6 mmol/L的FeSO4·7H2O溶液1 mL，加入6 mmol/L 的H2O2溶液1 mL，立即混匀，加入1 mL样品溶液混匀，静置10 min。再加入6 mmol/L的水杨酸钠溶液1 mL，37℃水浴30 min，然后4000 r/min离心10 min，取上清液在510 nm波长下测定吸光度A1，蒸馏水代替水杨酸钠溶液的吸光度为A2，60%乙醇代替样品溶液的吸光度为A0。按公式（3）计算清除率。

1.2.4.4 对铁离子还原能力的测定 在两种提取物及对照浓度均为0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL对各自的铁离子还原能力进行测定。采用铁氰化钾还原法［18］，向试管中加入样品溶液0.5 mL，再分别加入pH6.6的磷酸缓冲液2.5 mL、5%铁氰化钾2.5 mL，混匀后密封，50℃水浴20 min，然后冰浴急速冷却，再加入10%的三氯乙酸2.5 mL，混匀并离心10 min（4000 r/min）。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水，再加入0.5 mL 0.1%的三氯化铁显色，静置10 min，700 nm波长处测定其吸光值A1，以60%乙醇代替样品溶液为A0，Fe3+总还原力=A1-A0，A1-A0越大说明Fe3+总还原力越强。

1.3 数据处理

采用Curve Expert 1.4软件进行曲线拟合，SPSS 14.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

由图1可知，没食子酸标准曲线y=0.0046x+0.0177，R2=0.9958，表明没食子酸在40～200 μg/mL质量浓度的范围内，吸光度与质量浓度间呈良好线性关系。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Gallic acid standard curve

由图2可知，芦丁标准曲线y=0.014x+0.0167，R2= 0.9985，表明芦丁在20～70 μg/mL质量浓度的范围内，吸光度与质量浓度间呈良好线性关系。

图2 芦丁标准曲线Fig.2 Rutin standard curve

2.2 样品纯度的测定

采用分光光度法测定提取物的纯度，乙醇提取物总多酚的纯度为39.02%，总黄酮的纯度为10.19%；丙酮提取物总多酚的纯度为44.09%，总黄酮的纯度为14.59%。表明丙酮提取物中的总多酚和总黄酮纯度都高于乙醇提取物。

2.3 松仁膜衣提取物对ABTS+·的清除活性

ABTS法是评价天然产物的总抗氧化能力常用方法之一［19］。松仁膜衣提取物对ABTS+·清除能力测定结果见图3。

图3 松仁膜衣提取物、BHT和VC对ABTS+·的清除作用Fig.3 Sscavenging activity of pine nut coated-film extracts，VC，and BHT against ABTS radical

由图3可知，松仁膜衣提取物对ABTS+·的清除作用随浓度的增加而增强，呈现很好的剂量效应关系。根据曲线拟合方程并计算IC50值，结果见表1。

根据表1中拟合方程，求得乙醇提取物50%清除浓度IC50值为90.16 μg/mL，丙酮提取物的IC50值为66.70 μg/mL，阳性对照VC和BHT的IC50值分别为34.75 μg/mL和30.41 μg/mL，比较IC50值发现，清除作用最强的是BHT，其次是VC和丙酮提取物，最弱的是乙醇提取物。虽然松仁膜衣提取物对ABTS+·的清除作用不及VC和BHT，但仍然表现出对ABTS+自由基具有一定的清除作用，且丙酮提取物显著强于乙醇提取物（p＜0.05）。

2.4 松仁膜衣提取物对DPPH·的清除活性

对DPPH·的清除能力被广泛用于天然产物抗氧化活性评价中［20］。红松仁膜衣提取物和VC对DPPH·的清除率测定结果见图4和图5。

表1 对ABTS+·的清除作用拟合方程及IC50值Table1 ABTS radical scavenging effect of fitting equation and IC50

表2 对DPPH自由基的清除作用拟合方程及IC50值Table2 DPPH radical scavenging effect of fitting equation and IC50

图4 松仁膜衣提取物和BHT对DPPH的清除作用Fig.4 Scavenging activity of pine nut coated-film extracts and BHT against DPPH radical

图5 VC对DPPH·的清除作用Fig.5 Scavenging activity of VCagainst DPPH radical

由图4、图5可知，松仁膜衣提取物对DPPH·的清除能力随提取物质量浓度的增加而增强，并且呈现一定的剂量效应关系。根据曲线拟合方程并计算IC50值，结果见表2。

根据表2中拟合方程，求得乙醇提取物50%清除浓度IC50值为1237.55 μg/mL，丙酮提取物的IC50值为1016.02 μg/mL，阳性对照VC和BHT的IC50值分别为8.19 μg/mL和24139.4 μg/mL，比较IC50值发现，清除作用最强的是VC，其次是丙酮提取物和乙醇提取物，最弱的是BHT。由此可知，松仁膜衣提取物对DPPH·的清除能力不及VC，但极显著高于BHT（p＜0.01）。表明松仁膜衣提取物对DPPH·具有显著的清除作用，并且丙酮提取物对DPPH·的清除作用与乙醇提取物的清除作用相当（p＞0.05）。

2.5 松仁膜衣提取物对·OH的清除活性

·OH是活性氧中化学性质最活泼的自由基，它几乎能与细胞中任何生物大分子发生反应，且反应速度极快，是对机体危害非常大的自由基［21］。松仁膜衣提取物对·OH的清除作用，结果见图6。

图6 松仁膜衣提取物和VC对羟自由基的清除作用Fig.6 Hydroxyl radical scavenging activity of pine nut coated-film extracts and VC

由图6可知，随提取物质量浓度的增加，对·OH的清除能力逐渐增强，呈现一定的剂量效应关系。根据曲线拟合方程并计算IC50值，结果见表3。

表3 对羟自由基的清除作用拟合方程及IC50值Table3 Hydroxyl radical scavenging effect of fitting equation and IC50

根据表3中拟合方程，求得乙醇提取物50%清除浓度IC50值为1539.19 μg/mL，丙酮提取物的IC50值为1295.07 μg/mL，阳性对照VC的IC50值为400.73 μg/mL，比较IC50值发现，清除作用最强的是VC，其次是丙酮提取物，最弱的是乙醇提取物。松仁膜衣提取物对·OH的清除作用虽不及VC，但对·OH具有明显的清除作用，并且丙酮提取物对·OH的清除作用显著强于乙醇提取物（p＜0.05）。

2.6 松仁膜衣提取物对铁离子的还原能力

还原力的测定实质上是检验物质是否为良好的电子供应者的过程［22］。松仁膜衣提取物还原铁离子能力，结果见图7。

图7 松仁膜衣提取物、VC和BHT还原铁离子能力Fig.7 Reducing ability of pine nut coated-film extracts，VCand BHT against Fe3+

由图7可知，松仁膜衣提取物对铁离子的还原能力不及VC，且低浓度时松仁膜衣提取物还原铁离子的能力也低于BHT，但浓度大于0.4 mg/mL时，松仁膜衣提取物还原铁离子能力要高于BHT。结果表明，松仁膜衣提取物具有较好的铁离子还原能力，丙酮提取物的还原铁离子能力与乙醇提取物相当。

3 结论

丙酮提取物中的总多酚和总黄酮纯度均高于乙醇提取物。通过多个氧化反应体系实验，红松松仁膜衣乙醇提取物和丙酮提取物均表现出良好的抗氧化活性，其对ABTS+·、DPPH·、·OH的清除能力和对铁离子的还原能力均随质量浓度的增加而增强，呈现一定的剂量效应关系，并且对DPPH·的清除作用和对铁离子的还原能力均高于BHT；丙酮提取物对ABTS+·和·OH的清除能力显著高于乙醇提取物，表明丙酮提取物的抗氧化能力强于乙醇提取物。红松松仁膜衣提取物的抗氧化活性与总多酚和总黄酮的纯度呈正相关，可以考虑选择丙酮提取物进行后续的生物活性的深入研究。

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Antioxidant activities in vitro of pine nut coated-film extracts from Pinus koraiensis

ZHANG Xiao-ru1，LI Xing2，WANG Bin2，WANG Zeng-kai1，XU Hong-yan1，*
（1.Agricultural College of Yanbian University，Yanji 133002，China；2.Yanji Shoei Foods Co.，Ltd.，Yanji 133000，China）

It was to find out the antioxidant activities of Pinus koraiensis pine nut coated-film from Changbai Mountain.60%ethanol and 50%acetone were used，and the extracts were obtained by vacuum freeze-drying.The purity of total polyphenol and total flavonoids of the extracts were measured by spectrophotometry.The free radical scavenging abilities and reducing iron power also were studied in this experiment.The results showed that polyphenol purity of pine nut coated-film ethanol extract was 39.02%，the flavonoid purity was 10.19%.The polyphenol purity of acetone extract was 44.09%，the flavonoid purity was 14.59%.The scavenging capacity of pine nut coated-film extract on ABTS+·，DPPH·and hydroxyl radical（·OH）was of dose-dependent relationship including the ability of reducing iron power.Its scavenging effects on DPPH·and the ability of reducing iron power were better than that of BHT.And scavenging effects of acetone extracts on DPPH·and ·OH were notable better than that of ethanol extracts.These results showed that the antioxidant capacity of acetone extracts was higher than that of ethanol extracts.At the same time，there was positive correlation between the antioxidant capacity of Korean pine nut coated-film extracts and the purity of total polyphenol and total flavonoids in experiment extent.

Pinus koraiensis；pine nut coateded-film；antioxidant activity

TS255.1

A

1002-0306（2016）06-0142-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.020

2015－06－12

张晓茹（1991-），女，大学本科，研究方向：天然活性物质功能作用，E-mail：919958472@qq.com。

徐红艳（1975-），女，博士，讲师，研究方向：天然活性物质分离与功能性食品，E-mail：xuhongyan@ybu.edu.cn。

吉林省科技发展计划项目（20150204063NY）；延边大学大学生创新计划项目（ydbksky2015244）。