沙柳组培技术初探

敖 敦，杨海峰，王 雷，马月林

(内蒙古农业大学林学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

沙柳组培技术初探

敖 敦，杨海峰，王 雷，马月林

(内蒙古农业大学林学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

以沙柳茎段为外植体，开展不同基本培养基，植物生长调节剂ZT、NAA组合的筛选试验。结果表明，在ZT、NAA组合，沙柳幼芽高生长最佳培养基为1/2 WPM+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，沙柳最佳生根培养基为1/2 WPM+ZT 0.1 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1。在参试的MS、WPM、B5、DCR、White 5种培养基中，最适合沙柳幼芽茎段诱导及生根的培养基为WPM，叶片较绿，根较长，生长较快。

沙柳；组织培养；幼芽生长；生根率

沙柳(Salixpsammophila)别名北沙柳，为杨柳科落叶丛生直立灌木或小乔木。树高3～5 m，枝细长、有毛、后变光滑、带紫色；芽锐尖，具有柔毛[1]。沙柳喜湿润，容易繁殖，适应性广[2]。同时，可用作燃料、优质的家畜饲料及纤维板、刨花板、纺织、造纸的重要原料[3]。沙柳广泛分布于鄂尔多斯、东阿拉善、陕西北部及宁夏东部[4]，是防风固沙的优良树种，是高速公路、铁路等路基护坡、矿山植被恢复的主要树种。沙柳具有抗逆性强，耐寒，耐旱，耐风沙盐碱等特点，是我国沙荒地区造林的优良树种之一，应用前景十分广阔。

沙柳人工丰产栽培及扦插育苗等方面的研究已有大量报道[5-10]。在柳树组织培养方面，国外Grönroos等[11]曾利用雌蕊及花序作为外植体进行愈伤诱导、体细胞胚胎发生的研究；还开展了不同基本培养基的对比试验[12-13]，认为基本培养基对于某些特定基因型具有一定优势；在生长调节剂的筛选研究发现离体培养的形态发生效率更依赖于参试的基因型。国内对柳属的组织培养研究相对较多[14-19]，对沙柳的组织培养研究极少，杜喜梅等[3]采用1年生沙柳春季萌发嫩枝为外植体，筛选出较适宜的分化增殖培养基与继代培养基；杨海峰[20]在沙柳组织培养研究中发现了适宜沙柳嫩枝诱导与根诱导的较适宜培养基及植物生长调节剂配比，发现WPM更适宜沙柳嫩枝的组织培养，叶片较绿，根较长，生长较快。

本研究以沙柳休眠芽为外植体，诱导无菌嫩枝，采用ZT、NAA组合进行植物生长调节剂浓度筛选及基本培养基的筛选，摸索适合沙柳无菌芽诱导的基本培养基类型及适合的植物生长调节剂浓度。本研究可为沙柳优良无性系组培快繁体系的建立，以及利用沙柳快繁体系展开沙柳的细胞遗传学研究建立基因工程转化提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

试材采自内蒙古农业大学苗圃，种源纳林河，树皮颜色灰绿，雄株，编号：08-3。以沙柳休眠的1～2年生木质化茎段为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 沙柳外植体休眠枝茎段消毒及诱导 将枝条用洗洁精在流水下清洗后剪成约2～3 cm茎段，每个茎段保留1～2个休眠芽放入烧杯中，洗洁精水浸泡30 min，再继续清水冲洗3 h，不断震荡洗涤。茎段移入灭菌超净工作台，先用75%酒精消毒，再用2%次氯酸钠加入几滴吐温，不停振荡摇晃消毒2次，用无菌水清洗，期间转入新无菌瓶中，减少污染几率。无菌水清洗至没有泡沫为止。然后将消毒后的茎段两端切除3～5 mm插入培养基中，所有培养基均附加蔗糖20 g·L-1、植物凝胶3 g·L-1，调节pH至5.8，封口，置于25 ℃，16 h光照，8 h黑暗条件的光照培养箱内进行培养。每天观察记录、拍照1次。培养30 d后对苗高进行统计。

1.2.2 植物生长调节剂种类及浓度筛选 选1/2 WPM为基本培养基，植物生长调节剂采用ZT、NAA，设置30个组合，ZT质量浓度分别为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1，NAA质量浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1。接种选用无菌嫩枝为外植体，切成约2 cm带芽茎段，接种至培养基。每个组合10瓶，每瓶接种2个外植体，4次重复。

1.2.3 基本培养基的筛选 选用MS、WPM、B5、DCR、White等5种基本培养基，均附加蔗糖20 g·L-1、植物凝胶3 g·L-1，添加NAA 2 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1后调节pH至5.8。每个组合10瓶，每瓶接种2个外植体，4次重复。

2 结果与分析

2.1 沙柳无菌苗诱导培养观察

沙柳茎段培养第5天，叶腋处腋芽开始萌动，鳞芽增大，长出绿色芽点；随后14 d左右，嫩枝基部可见红色根尖，腋芽逐渐伸长，深绿色幼嫩叶片逐渐展开；培养45 d时，侧芽平均高度约为4 cm，平均根长约为6 cm(图1)。

2.2 ZT、NAA不同浓度组合对沙柳幼芽高生长的影响

培养30 d后苗高统计结果见表1。由表1可知：在ZT 0.1 mg·L-1时，随NAA质量浓度增大，苗高表现为降低→增高→再降低的趋势；在ZT 0.5～1.0 mg·L-1时，随NAA质量浓度增大，苗高表现为先增高后降低的趋势，苗高最高达到1.7 cm；在ZT 1.5～2.0 mg·L-1时，随NAA质量浓度增大，苗高表现降低的趋势。总体而言，随着ZT质量浓度的增大，沙柳嫩枝高生长呈现显著下降趋势，可见，ZT对沙柳幼苗的高生长抑制效果显著。最佳幼芽高生长培养基为1/2 WPM+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。

2.3 ZT、NAA不同浓度组合对沙柳嫩枝生根的影响

培养30 d后沙柳嫩枝生根率统计结果见表1。从表1可以看出，随着ZT浓度的增加，其生根率出现下降趋势，在ZT为0.1～0.5 mg·L-1时，生根率随着NAA的增加呈现增高趋势，说明NAA对生根有促进作用；在ZT为2.0 mg·L-1时，生根率均为0，说明高浓度的ZT对沙柳嫩枝生根的抑制作用显著。最适宜的嫩枝生根培养基为1/2 WPM+ZT 0.1 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1+pH 5.8。

2.4 不同基本培养基对沙柳幼芽茎段诱导及生长的影响

在5种基本培养基培养9 d后，叶腋处腋芽部分开始萌动，出现淡绿色芽尖，茎段基部部分开始出现红色根尖。在WPM培养基上，沙柳生长速度快，叶片比较绿，且没有出现叶片黄化现象。在MS培养基，沙柳生长速度较慢，叶片前期生长比较绿，但后期逐渐黄化。而DCR、White、B5等培养基，沙柳生长速度缓慢，而且均出现黄化现象。

2.5 不同基本培养基对沙柳嫩芽生根的影响

生根培养30 d后发现，WPM、MS、DCR等3种基本培养基上的嫩枝生根率达到了100%，而B5和White培养基上的嫩枝生根率只有达到40%。综合沙柳茎段萌生嫩枝与长势及根的长势，认为WPM培养基为沙柳幼芽茎段生根的最佳基本培养基。

3 结论与讨论

在ZT、NAA组合中沙柳嫩枝幼芽高生长最佳培养基为1/2 WPM+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。沙柳嫩枝最佳生根培养基为1/2 WPM+ZT 0.1 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1。选用的5种基本培养基中沙柳嫩枝生长的最佳基本培养基为WPM。

细胞分裂素不仅能促进植物细胞的分裂和扩大，而且在芽分化的诱导、叶绿体的发育、养分的运输和分配、细胞衰老的抑制等方面都表现出显著的效果[20]。生长素能促进根和茎的发育和生长、器官的衰老、维管束组织的形成和分化发育，以及植物的向地和向光反应等[21]。但不同种类的生长素和细胞分裂素对植物生长的影响不一定相同。本研究发现随着ZT浓度的增加幼芽的高生长受抑制，其生根率也明显下降。一般低浓度的细胞分裂素可促进高生长，而高浓度的细胞分裂素促进侧芽生长而抑制高生长，但在本研究中，即使低浓度的ZT也表现出对高生长的抑制作用，其原因可能是沙柳对ZT非常敏感。在前期研究中[20]，发现低浓度6-BA对嫩枝高生长和生根表现为促进作用，高浓度时显示出抑制作用，因此，6-BA可作为一种更适合的细胞分裂素应用于沙柳的组织培养研究中，应谨慎采用ZT。对于细胞生长素的应用，本研究主要采用了NAA，初步研究认为NAA对沙柳幼苗生长及生根均有较好的促进作用，与前期研究结果一致[20]。在今后的研究中，可借鉴杜喜梅等[3]采用的6-BA与KT组合，有可能取得更好的培养效果。

表1 沙柳嫩枝在1/2 WPM+ZT+NAA培养基上生长状况统计

*：同列不同小写字母为0.05水平上差异显著。下同。

表2 不同基本培养基上沙柳嫩枝茎段生长状况比较

基本培养基中含有植物生长所需要的营养物质，是植物组织培养中不可缺少的基础营养物质，培养基的类型与组织培养的成功有很大关系。本研究采用MS、WPM、B5、DCR、White 5种基本培养基对沙柳嫩枝的组织培养差异较大。WPM是一种低盐培养基，适应木本植物生长。本研究也发现该培养基比较符合沙柳的生长，长势较好，生长较快，这可能由于沙柳生长在我国西北地区，生长环境十分贫瘠，沙柳已适应低养分的生长环境。在高盐培养基MS中培养发现，沙柳嫩枝长势低于WPM培养基，生长较慢，所以MS培养基可能不适合沙柳的组织培养。在培养基B5中，沙柳生长较慢，B5中含有较低的铵，这可能对沙柳的生长有抑制作用。在低盐培养基DCR、White等培养基中，沙柳生长也较差，可能与培养基本身营养成分的差异有关，如DCR中K元素含量低，而适宜沙柳生长的WPM培养基中含有大量的K，可能是K、S等含量较低导致DCR对沙柳生长作用不大。在杜喜梅等[3]对沙柳以及余如刚等[19]对旱柳的组培研究中发现生长较好的基本培养基为MS培养基，与本研究所发现WPM为适宜培养基有所差异，这有可能与采用的沙柳基因型以及外植体差异有关。

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The Initial Exploration on Tissue culture ofSalix

AO Dun，YANG Hai-feng，WANG Lei，MA Yue-lin

(CollegeofForestry，InnerMongoliaAgriculturalUniversityHohhot010019，Neimenggu，China)

Taking theSalixbuds as explants，screening experiment the different basic culture medium and ZT、NAA combination.The results showed that in the ZT、NAA combination，medium 1/2 WPM+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1is suitable for shoots growth and the best suitable rooting medium is 1/2 WPM+ZT 0.1 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1.The results showed that WPM basic medium is suitable for shoots induction and rootage growth between the MS、WPM、B5、DCR、White five basic medium，buds with the green leaves，fast roots growth.

Salixpsammophila；tissue culture；shoots growth；rooting rates

2015-03-09；

2015-04-17

中国林业科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(胡杨功能基因组研究平台构建和功能基因发掘，CAFYBB2011001)；国家自然科学基金资助项目(利用拟南芥突变体鉴定木材发育相关基因功能研究，31360187)；内蒙古自治区高等学校科学研究项目(胡杨大片段DNA转化拟南芥研究，NJZY13076)

敖敦(1989—)，女(蒙古族)，内蒙古赤峰人，内蒙古农业大学林学院硕士研究生，从事园林植物与人居环境研究。E-mail：aodun520@sina.cn。

杨海峰(1975—)，男(蒙古族)，内蒙古呼和浩特人，内蒙古农业大学林学院副教授，博士，从事林木遗传育种、林木基因工程的研究与教学工作。E-mail：yang_hf888@163.com。

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.01.018

S723.1+32.6

A

1002-7351(2016)01-0080-04