镉在企鹅珍珠贝组织器官中的分布及其存在形态研究

廖 艳，吴育廉，吴晓萍，章超桦（.广东海洋大学现代生物化学实验中心，广东湛江54088；.广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室/国家贝类加工技术研发分中心（湛江），广东海洋大学食品科技学院，广东湛江54088）

镉在企鹅珍珠贝组织器官中的分布及其存在形态研究

廖 艳1，吴育廉1，吴晓萍2，章超桦2
（1.广东海洋大学现代生物化学实验中心，广东湛江524088；2.广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室/国家贝类加工技术研发分中心（湛江），广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

为研究企鹅珍珠贝组织器官中镉的分布及形态，实验采用石墨炉原子吸收光谱法和凝胶层析技术分析了镉在贝体不同组织器官中的分布、存在形态和相对分子质量分布。结果表明，企鹅珍珠贝各组织器官中镉的含量分别为：全脏器2.33 mg/kg，外套膜2.50 mg/kg，闭壳肌2.40 mg/kg，内脏团2.38 mg/kg，斧足2.24 mg/kg，鳃1.42 mg/kg。全贝中83.3%的镉蓄积在企鹅珍珠贝的内脏团、闭壳肌和外套膜中。企鹅珍珠贝各组织器官中只有不到40%的镉以可溶性蛋白结合态的形式存在。各组织器官的可溶性热稳定蛋白经Sephadex G-50凝胶过滤柱层析分离后，均得到相对分子质量＞26000 u和＜16000 u的两个蛋白质的紫外吸收峰。内脏团、外套膜和腮中的镉在两种分子质量段的蛋白质中均有分布；闭壳肌中少量镉与大分子蛋白质结合，其余近90%的镉分布在非蛋白组分中；斧足中镉几乎完全与大分子蛋白质结合。研究表明，镉在企鹅珍珠贝组织器官中的分布及形态存在差异性。

企鹅珍珠贝，镉，分子量分布，形态

双壳贝类具有非选择性滤食习性，在受污染的海域中生长的贝类极易富集环境中的有害物质，如致病菌、贝类毒素［1］、农兽药残［2］和重金属［3］等。水体中呈游离态的重金属离子进入生物体内，将与生物大分子（如特定蛋白质）或金属硫蛋白（metallothionein）相结合，或以离子或低分子络合离子的形式积累［4］。由于重金属在生物体内的形态不同，其产生的毒性效应也有所不同。相关研究显示重金属镉（Cd）在水生生物尤其是双壳贝类体内的污染情况不容乐观［5-6］。由于镉在水生生态系统中呈现较为复杂的形态，且不同生物对镉的吸收和排出规律不同，因此，本文以企鹅珍珠贝为研究对象，对其全脏器及各组织器官中的镉含量进行检测，并对镉在各器官中的存在形态和结合态镉在不同分子质量段蛋白质中的分布情况进行分析，探索镉在贝类体内的存在形态，以期为企鹅珍珠贝蛋白质资源的合理利用提供数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

企鹅珍珠贝 采集于广东省徐闻县芳华珍珠养殖场，贝龄2.5年；镉标准贮备液GBW08612（1.0 mg/mL）国家标准物质研究中心；贻贝标准GBW08571 中国科学院生态环境研究所国家海洋局第二海洋研究所；葡聚糖凝胶Sephedex G-50（中粒度） 北京鼎国昌盛生物技术有限公司；标准分子质量物质 磷酸异构酶triosephosphate-isomerase（26625 u）、肌球蛋白myoglobin（16950 u）、抑肽酶aprotinin（6512 u）、胰岛素B insulin-B（3496 u）、杆菌肽bacitracin（1423 u）

美国Bio-Rad公司；马尿酰-组氨酰-亮氨酸NHippuryl-His-Leu hydrate（433 u） 北京华美生物技术有限公司；盐酸、硝酸、高氯酸 均为优级纯；其他试剂 均为分析纯；实验用水 超纯水。

LC-20AT高效液相色谱仪 日本岛津公司；Z-5000塞曼原子吸收光谱仪、CR-22高速冷冻离心机、U-3310紫外分光光度计 均为日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 企鹅珍珠贝去壳、除杂，取全脏器依次用蒸馏水、超纯水迅速洗净，沥干，于冰上按器官分解为内脏团、闭壳肌、外套膜、腮和斧足五部分，分别称重后用高速组织匀浆机匀浆，于-18℃下冻藏备用。

1.2.2 样品制备 参考文献方法［7］，企鹅珍珠贝各脏器经解冻后，与经4℃预冷的0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.6，含0.5 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）和1 mmol/L 2-巯基乙醇按1∶2（W/V）的比例在高速匀浆机中匀浆5 min，均质物于4℃冰箱静置过夜。均质物于4℃下离心（10000 r/min）30 min，除去沉淀（Tris-HCl不溶物），上清液（可溶性蛋白）经80℃水浴加热5 min除热变性蛋白，冰浴冷却5 min，再次于4℃下离心（10000 r/min）30 min，取上清（热稳定蛋白）供凝胶层析分离使用。Tris-HCl不溶物、可溶性热稳定蛋白和热变性蛋白均留样进行镉元素测定。

1.2.3 可溶性热稳定蛋白的层析分离 取5 mL可溶性热稳定蛋白用Sephadex G-50进行凝胶层析（层析柱为2.6 cm×40 cm），以0.01 mol/L Tris-HCl（pH8.6）缓冲液在1 mL/min的流速下洗脱，每管收集8 mL，分别对各管层析液进行紫外检测和镉元素测定。

1.2.4 镉元素的测定 凝胶层析液直接用石墨炉原子吸收光谱法测定镉含量（ng/mL）；其他样品处理参照国标（GB/T 5009.15.2003）方法［8］，经湿式消化后同上测定镉含量。按同样消解方法做空白实验，并采用国家标准物质贻贝（GBW08571）验证方法的准确度。消化液中镉含量（ng/mL）经质量换算得到试样中镉含量（mg/kg）。

1.2.5 镉含量的计算

式（1）中：X：凝胶层析洗脱峰中镉相对含量（%）；N1：洗脱峰含镉量（ng）；N0：总镉量，即各洗脱峰含镉量之和（ng）。

式（2）中：Y：器官（组分）中镉相对含量（%）；M1：器官（组分）含镉量（mg）；M0：总镉量，即各器官（组分）含镉量之和（mg）。

1.2.6 蛋白质相对分子质量的测定 可溶性蛋白的热稳定组分经凝胶层析分离，紫外光谱检测，取各洗脱峰在280 nm波长处有最大吸收值处的馏分，采用高效空间排阻色谱法（HPSEC）进行相对分子质量的测定。分析柱为PROTEIN-PAK 60（WAT085250），流动相为0.05 mol/L Tris-HCl（pH7.2），流速0.7 mL/min，检测波长214 nm，温度25℃。

2 结果与分析

2.1 镉在企鹅珍珠贝组织器官中的分布

企鹅珍珠贝全脏器及不同组织器官中镉的含量测定结果见表1。由表1可知，企鹅珍珠贝的腮中镉含量稍低（1.42 mg/kg），其他器官中镉的含量都比较接近（2.24～2.50 mg/kg）。从镉的相对含量分布上看，企鹅珍珠贝的内脏团、闭壳肌和外套膜中的镉占总镉量的83.3%，为主要蓄积镉的器官。镉在不同贝类体内分布规律并不一致，除了受生长环境的水质影响外，这可能与贝类种间差异对重金属的吸收、累积途

径不同有关。

表1 镉在企鹅珍珠贝各组织器官中的分布（湿基，n=3）Table1 Distribution of Cd in different organs of Pteria penguin（wet basis，n=3）

2.2 镉在企鹅珍珠贝组织器官中的存在形态

企鹅珍珠贝各组织器官不同提取组分中镉的分布情况见图1。由图1可知，镉在企鹅珍珠贝体内分别以Tris-HCl不溶态、热稳定蛋白结合态和热变性蛋白结合态存在，这三种形态的镉在各组织器官中的比例各不相同。其中，各组织器官均有超过60%的镉以Tris-HCl不溶态存在。可溶性蛋白中镉的含量分布依次为：内脏团＞闭壳肌＞腮＞斧足＞外套膜；可溶性蛋白经热处理后镉损失最多的为外套膜，接近三分之二，内脏团和斧足约损失一半左右，闭壳肌和腮则较少。这可能是因为构成各组织器官的蛋白质组成和热敏蛋白含量不同而导致。

图1 镉在企鹅珍珠贝各组织器官不同提取组分中的分布Fig.1 The distribution of Cd in the different fractions of organs from Pteria penguin

2.3 镉在企鹅珍珠贝组织器官可溶性热稳定蛋白中的相对分子质量分布

企鹅珍珠贝各组织器官的可溶性热稳定蛋白经Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，测定每管洗脱液在280 nm处的紫外吸收值及相应的镉含量，并绘制柱层析洗脱曲线（图2）。从图2中可以看出，各组织可溶性热稳定蛋白组分经Sephadex G-50凝胶过滤柱层析分离后均得到两个蛋白质的紫外吸收峰。内脏团、外套膜和腮的洗脱液中，镉的吸收峰与两处蛋白质吸收峰基本重合，且镉含量与蛋白含量的变化趋势一致，由此可推断在这三种器官中镉可能与这两种蛋白质相结合而存在；在闭壳肌的洗脱液中，少量镉在第一峰处，而绝大部分镉出现在两个蛋白质吸收峰间，表明小部分镉与大分子蛋白质相结合，大部分镉可能与其他物质结合；在斧足中，几乎全部镉出现在第一峰处，表明斧足中的镉基本都存在于大分子蛋白中。

经换算可得洗脱液中镉的含量分布，见图3。由图3可以看出，闭壳肌中少量镉与大分子蛋白质结合，其余89.83%的镉分布在非蛋白组分中；内脏团的两个蛋白质吸收峰中的镉总量相差不大（47.82%，52.18%）；而外套膜和腮均为第一个峰中的镉含量较大（61.62%，77.79%），说明大分子蛋白质结合了较多的镉；斧足的热稳定组分中镉几乎完全与大分子蛋白质结合（99.26%）。各组织器官可溶性蛋白质热稳定组分大分子蛋白中镉所占的百分比顺序依次为：斧足＞腮＞外套膜＞内脏团＞闭壳肌，在小分子蛋白中

所占的百分比顺序为：内脏团＞外套膜＞腮＞斧足＞闭壳肌。镉在企鹅珍珠贝不同组织器官中与不同相对分子质量蛋白质的结合情况差异很大，说明镉与蛋白质的结合是具有选择性的，可能是由于不同组织器官的功能蛋白质组成不同造成。

图2 各组织器官可溶性热稳定蛋白组分的Sephadex G-50凝胶层析图谱Fig.2 Sephadex G-50 gel chromatography of heat stable components of soluble protein from organs

图3 镉在各组织器官Sephadex G-50凝胶层析洗脱液中的分布Fig.3 The distribution of Cd in eluate of Seph adex G-50 gel chromatography from organs

用已知相对分子质量的标准物质对HPSEC柱进行标定，将各分子质量的对数值（logMr）与相应的保留时间（tR，min）作图，其线性方程为logMr=6.4972-0.2261tR，相关系数r=0.9877。在相同实验条件下对样品进行分离分析，通过该线性方程，可估算出色谱图上各分离组分的分子量大小。取各个组织器官的可溶性热稳定蛋白层析液第一峰和第二峰A280 nm最大处的馏分，用HPSEC进行分离测定。图4为内脏团热稳定组分层析液的HPSEC图谱，其他组织器官与该图谱近似（略）。根据相对分子质量校正曲线，各个组织器官第一洗脱峰主要是相对分子质量远大于26000 u的组分，第二洗脱峰蛋白质组成较杂，由相对分子质量小于16000 u的多组分组成。

图4 柱层析两处洗脱峰的HPSEC图谱Fig.4 HPSEC chromatogram of two elution peaks by column chromatography

3 讨论

从中国人的传统食用习惯来看，腹足类的贝类，一般选食其肌肉部分（腹足），如海螺、鲍鱼等；双壳类的贝类，很多是食用整个软体部，如牡蛎、蛤、贻贝等；有的贝类只食其闭壳肌，如常见的干贝、江瑶柱，分别为扇贝和江瑶的闭壳肌干制品。从已有的研究报道来看，无论是双壳类，还是腹足类，均是肌肉中的重金属含量最低，而内脏团（含消化系统、生殖系统等）的重金属含量高，因此有观点认为，食用贝类海鲜时，最好去除贝类内脏团，食用剩下的贝类肌肉部分会更安全［10］。而根据笔者对镉在企鹅珍珠贝的不同化学组分及各种蛋白质组分中的分布情况的研究［11-12］，并结合本研究的结果，可以发现，镉在企鹅珍珠贝的内脏团中蓄积量最高，其次是闭壳肌和外套膜，无论是食用整个软组织或其肌肉，都可能存在摄入过量重金属的风险。因此，直接食用或对贝类进行加工利用时，应选择清洁的原料，或进行相应的重金属脱除工艺。

重金属在生物体内的存在形态与生物体的种类、重金属进入体内的形态、吸收途径、在体内的积累方式等都有很大的关系。目前，有关生物体中镉的存在形态研究主要关注的热点是镉金属硫蛋白（MT）。也有一些研究发现，不同生物体内的镉会与不同分子量段的蛋白质相结合，这些镉结合蛋白并不一定都是金属硫蛋白。如High等［13］用凝胶层析法对污染地区贻贝中的镉结合蛋白进行分离时，除发现分子量约6000～7000 u的类似哺乳动物体内的金属硫蛋白类物质外，还得到了分子量约60000 u的镉-蛋白质结合物。在帽贝中也有类似物质存在，凝胶层析得到分子量分别为10800 u和22000 u的Cd-SH配合物。在牡蛎中的镉，则与分子量为50000 u以上和3000 u以下的蛋白质相结合。廖琳［14］在对海豚肝脏的研究中发现，可溶性含镉物质以两种不同分子量的形态存在，其分子量大部分都在3000～70000 u范围内，一部分分子量小于3000 u，这些含镉蛋白质均不是镉金属硫蛋白。Bin Li等［15］采用分子排阻色谱-电感耦合等离子质谱（SEC-ICP-MS）分析了南极鳞虾水提物中不同分子量金属复合物的元素分布，发现镉主要分布在相对分子质量大于20000 u的物质中。赵艳芳等［16］在扇贝中检测到3种Cd形态：MT-Cd、谷胱甘肽（GSH）-Cd和半胱氨酸（Cys）-Cd，在菲律宾蛤仔中检测到2种Cd形态：MT-Cd和GSH-Cd。文献中报道的不同生物体内镉结合蛋白的分子量分布并不一致，本研究中，企鹅珍珠贝体内镉与不同分子量蛋白质结合的情况也与其他贝类不同，这些都体现了生物的多样性。

4 结论

本研究表明，企鹅珍珠贝的内脏团、闭壳肌和外套膜中的镉含量占总量的83.3%，可以推测这三个器官为蓄积镉的主要器官。在体内各器官中，镉的存在状态有Tris-HCl不溶态、热稳定蛋白结合态和热变性蛋白结合态，且在不同器官中的比例亦不相同。各器官中分离得到的可溶性热稳定蛋白经凝胶层析分离后，均可得到相对分子质量＞26000 u和＜16000 u的两个蛋白质的紫外吸收峰，其中，内脏团、外套膜和腮中镉的分布与上述两种分子质量段的蛋白质分布情况基本重合，其他器官中的重合情况不明显，进一步说明不同器官中镉的结合情况可能不同。这是否能暗示二者在不同器官中的结合状态特点，有待进一步的研究。此外，企鹅珍珠贝体内超过62%的镉存在于Tris-HCl不溶物中，且在不同器官不溶物中镉的百分含量不同，这部分镉的形态、结构和性质也有待更深入的研究。

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Distribution and speciation studies of cadmium in the Pteria penguin tissues and organs

LIAO Yan1，WU Yu-lian1，WU Xiao-ping2，ZHANG Chao-hua2
（1.Modern Bio-Chemical Laboratory Center，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing（Zhanjiang），College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

The distribution，speciation and molecular weight distribution of cadmium（Cd）in the Pteria penguin tissues and organs were studied by graphite furnace atomic absorption spectrometry and gel filtration chromatography technology.The results showed that the contents of Cd in the various tissues and organs of the Pteria penguin were 2.33 mg/kg the whole viscera，2.50 mg/kg mantle，2.40 mg/kg adductor muscle，2.38 mg/kg visceral mass，2.24 mg/kg foot，1.42 mg/kg gill.83.3%of the full shell Cd accumulation in visceral mass，adductor muscle and mantle in Pteria penguin.Less than 40%of the Cd in different tissues and organs of the Pteria penguin bound in the form of water soluble protein.Two ultraviolet absorption peaks of proteins，which had a relative molecular weight of more than 26000 u and less than 16000 u，were got after the isolation of soluble thermally stable protein of water soluble protein from every organ by Sephadex G-50 gel filtration column chromatography.The Cd in visceral mass，mantle and gill were distributed in two molecular weight proteins.About 90%Cd in adductor was distributed in nonprotein compounds while a small quantity of it was combined with proteins of high molecular weight.Nearly all the Cd of soluble thermally stable protein in foot were combined with proteins of high molecular weight.This research revealed that distribution and molecular weight distribution of Cd in the Pteria penguin tissues and organs differences.

Pteria penguin；cadmium；molecular weight distribution；speciation

TS201

A

1002-0306（2016）08-0176-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.028

2015-09-10

廖艳（1977-），女，硕士，实验师，研究方向：食品安全检测技术，E-mail：liaoyan39@163.com。

现代农业产业技术体系（CARS-48-07B）；广东省科技厅农业攻关项目（2010B 020313005）。