马铃薯StRab蛋白序列特征和亚细胞定位分析

高　文，谢从华

(1. 河南科技大学 林学院，河南洛阳　471003；2. 华中农业大学 园艺林学学院，武汉　430070)



马铃薯StRab蛋白序列特征和亚细胞定位分析

高文1，谢从华2

(1. 河南科技大学 林学院，河南洛阳471003；2. 华中农业大学 园艺林学学院，武汉430070)

为进一步探索StRab蛋白在胁迫反应中的功能及其作用机制，采用生物信息学、洋葱表皮亚细胞定位等方法进行研究。结果表明，StRab核酸序列为889 bp，其中，编码区为612 bp，编码203个氨基酸；StRab蛋白为稳定、可溶、非分泌的非跨膜蛋白，含有小G蛋白家族的全部序列特征， 且C端存在CAAX 基序。洋葱表皮细胞瞬时转化试验表明，StRab蛋白定位于细胞膜。说明：StRab蛋白是在细胞膜上发挥功能的膜附着蛋白，可能对马铃薯胁迫反应有重要作用。

马铃薯；StRab；生物信息分析；亚细胞定位

GTP结合蛋白(GTP-binding proteins)，也称G蛋白，是指可与鸟苷酸可逆结合的蛋白质家族，在细胞信号传递中发挥重要作用。该蛋白主要分为两类，一类是与膜受体偶合的异三聚体G蛋白，包含α、β和γ 3个亚基，相对分子质量为100×103左右；另一类是存在于细胞不同部位的小G蛋白，以单体形式存在且相对分子质量较小，一般为20×103～30×103[1]。小G蛋白大量存在于真核生物，因此被称为小G蛋白超级家族，根据其结构特征，又可分为5个家族，即 Ras家族、Rho家族、Rab家族、Ran家族和Arf家族[2-3]，但目前在植物中尚未发现Ras家族。

Rab蛋白是小G蛋白超级家族成员之一，在真核生物中分布很广且数量较大，如拟南芥有57个[4]、水稻有52个[5]、人类有60个以上[6]、酵母有11个[1]、秀丽隐杆线虫有29个[7]、果蝇有26个[7]， Rab蛋白的大量存在预示其可能在真核生物细胞发挥重要作用。同时，Rab蛋白除具备小G蛋白的结构特征外，还存在5个Rab家族特异基序、4个Rab亚家族特异基序，尤其是C末端存在CCSS基序，其独有的结构特征对其特异性的功能发挥有重要作用[8]。有研究表明，Rab蛋白可作为分子开关调控小泡运输的各方面，如小泡形成、移动、停靠、与目标融合等[9-10]；Rab蛋白还有很多其他方面的功能，如参与植物光和激素反应[11-12]、参与不同植物不同部位的生长发育过程[13-19]及参与多种胁迫反应[20-23]等。

本研究供试的StRab蛋白是通过快速克隆cDNA末端技术(RACE)从接种晚疫病菌(Phytophthorainfestans)的马铃薯水平抗性材料中获得，其mRNA在GenBank的登录号为EF091-876[24]。马铃薯是全球重要的粮食作物，其适应性强、生育期短、营养全面，是解决全球粮食短缺问题的重要作物[25]。2016年，中国启动马铃薯主粮化战略，预计到2020年马铃薯种植面积将超过666万hm2，适宜主食加工的品种种植比例将达到30%，主食消费占马铃薯总消费量的30%，即马铃薯作为粮食产业的重要性将得到很大提升。但目前晚疫病仍是影响全球马铃薯生产的重要病害[26]。在中国，每年因晚疫病造成的产量损失约10%～15%[25]，因此，提高马铃薯品种晚疫病抗性、培育抗病新品种是全球马铃薯生产中亟需解决的重要问题。以前曾采用RT-qPCR对超量表达StRab的马铃薯转基因株系进行分析，结果表明，其相对表达量远高于野生型；结合Southern杂交分析，选择单拷贝且表达量高的株系进行表型鉴定，结果显示，StRab超表达转基因株系对晚疫病菌的抗性增强[24]。

为进一步了解StRab基因的功能和作用机理，本研究拟采用生物信息学方法预测分析StRab氨基酸序列，并采用分子生物学方法构建其与GFP融合的植物表达载体，通过农杆菌侵染方式转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位分析，研究结果将为深入分析该基因的功能及其可能的作用机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α；根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404；克隆载体pMD18-T[宝生物工程(大连)有限公司]，其抗性标记为氨苄青霉素(Ampr)；具Kanr抗性标记的植物表达载体pBI121。ZEISS ImagerA1荧光显微镜和激光共聚焦显微镜ZEISS LSM510 META(德国，卡尔·蔡司股份公司)。

1.2基因分离

首先，设计EST(GenBank登录号DR751954)序列的特异引物gR3 (5′-CAGCCTCAAACTCTGCCAAGCCTCC-3′)，然后，根据SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 说明书进行扩增。再设计引物gR7(5′-CGCGGATCCCGGTAAATCCCTCCGTCAC-3′，带下划线的碱基为BamHⅠ酶切位点，其前面的CGC为保护碱基。下同)和gR8(5′-GGCGAGCTC- CAAACTTCCCTAATGTTCAATCAG-3′，带下划线的碱基为SacⅠ酶切位点，其前面的GGC为保护碱基。下同)， 并扩增获得StRab基因序列。

1.3生物信息学分析

通过ExPASy(http://www.expasy.ch)的ProtParam分析StRab蛋白的相对分子量和等电点等基本信息；采用TMHMM Server 2.0分析StRab蛋白的可能跨膜区域位置；采用SingalP 3.0分析StRab蛋白的信号肽；采用TargetP预测StRab蛋白的亚细胞定位情况；采用NLStrandamus预测StRab蛋白的核定位信号；采用MEGA4.0软件的Neibor-joining算法构建系统发育树；采用CD-Search分析StRab蛋白的结构域。通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的BLASTN进行序列比对分析。

1.4融合表达载体构建

设计引物gR7(5′-CGCGGATCCCGGTAAATCCCTCCGTCAC-3′)、StRab3′-fusion(5′-GTTCTTCTCCTTTACTCATGGATGAGCAA- CAGCCACCA-3′)、gfp5′-fusion(5′-TGGTGGCTGTTGCTCATCCATGAGTAAAGGAGA- AGAAC-3′)、gfp3′(5′-GGCGAGCTCAATTTTGTATAGTTCATCCAT-3′)，结合重叠延伸法，获得融合表达载体pBI121-StRab-gfp。同时，设计引物gfp1(5′-CGCGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3′)和gfp2(5′-GGCGAGCTC- AATTTTGTATAGTTCATCCAT-3′)，构建阳性对照载体pBI121-gfp。经检验正确后保存。

1.5洋葱表皮细胞瞬时表达系统

将含有目标质粒(pBI121-stRab-gfp)、阳性对照质粒(pBI121-gfp)、阴性对照质粒(pBI121)的根癌农杆菌LBA4404活化，侵染经过预处理的洋葱表皮，于MS固体培养基中25 ℃培养1～2 d(16 h光/8 h暗)。经ZEISS ImagerA1荧光显微镜进行GFP荧光的预观察后，再通过激光共聚焦显微镜ZEISS LSM510 META观察，滤光片为505～550 nm，激发光为488 nm。

2　结果与分析

2.1目的基因获取

通过RACE扩增获得StRab基因(图1)，结果显示，StRab核苷酸序列为889 bp，其中，编码区为612 bp，编码203个氨基酸。GenBank登录号为EF091876。

2.2StRab蛋白基本信息

对StRab蛋白进行预测分析(http://www.expasy.ch/cgi-bin/protparam)，结果显示，其分子式为C990H1560N268O312S7，相对分子质量为22.4×103，理论等电点为5.51，水溶液中的消光系数为24 535 mol·L-1·cm-1，脂肪系数为82.17，不稳定系数为30.14，平均疏水系数为-0.268，说明StRab蛋白性质比较稳定。进一步通过ExPASy(http://www.expasy.ch/tools)的SOSUI进行疏水性分析显示，StRab蛋白为可溶性蛋白。而经SignalP3.0 和TMHMM Server v2.0软件分析发现，StRab蛋白既无信号肽也无跨膜区域。说明：StRab蛋白是稳定、可溶、非分泌的非跨膜蛋白质。

2.3StRab系统进化分析

采用MEGA4.0软件分析StRab蛋白与小G蛋白不同家族中的部分氨基酸序列[27]在分类和进化上的关系(图2)，结果表明，StRab蛋白属于Rab家族。因此，将马铃薯中的Rab蛋白序列命名为StRab(GenBank 序列号ABK96799)。

实线表示引物位置，虚线表示基因编码区　Solid lines show the position of primers, and dotted lines show coding region of StRab

图2　小G蛋白的进化分析

2.4蛋白序列特征分析

通过多序列比对分析(图3)，获得StRab蛋白序列特征。结果表明，该序列具有小G蛋白的一般特征，如保守的GTP/GDP结合位点G3、G4，GTPase活性位点G1、G2，与下游效应子相互作用的位点41、43～45、60、69～70、73、77、79～82、169，及G结构域中的分子开关区域Ⅰ(33、38～46)和Ⅱ(66、68～78)。同时，该序列不仅具有Rab家族的具体特征，如RabF1：41～45；RabF2：58～62；RabF3：69～74；RabF4：77～81；RabF5：86～91，还具有Rab亚家族的特征，如RabSF1：7～10；RabSF2：23～34，37～39；RabSF3：112～118；RabSF4：167～172，这些特点对于鉴别Rab蛋白具有重要作用。另外，在StRab蛋白序列中还发现鸟苷酸交换因子(GEF)的作用位点38、42～49、56、58，GDP解离抑制剂(GDI)的作用位点41～42、44、62～63、70、72、74～76、79，及Rab护送蛋白(REP)的作用位点69～81。更重要的是，在StRab蛋白序列C端发现膜定位信号，即CCSS基序。通过ExPASy(http://www.expasy.ch/tools)的PrePS软件分析显示，在CCSS基序中的半胱氨酸残基(C)上可以进行异戊二烯化修饰。异戊二烯化修饰在Rab蛋白进行细胞定位和功能发挥中有关键作用[28]。

G1～G5. GTP/GDP结合区GTP/GDP binding domain；C. 异戊二烯化位点Prenylation loci；RabF. Rab家族特异的基序The motifs of Rab family；LeRab1A (AAA80678)、 NpRab (CAA69701)、CaRab (BAA76422) 和AtRab1C (CAB78756)序列均来自NCBI蛋白数据库LeRab1A (AAA80678)、NpRab (CAA69701)、CaRab (BAA76422) and AtRab1C (CAB78756) come from the NCBI database

图3StRab蛋白保守结构域分析

Fig.3Conservative structure analysis of StRab proteins

2.5StRab亚细胞定位的软件预测

通过psort(http://www.psort.org)的PSORT 6.4、SLP-Local等软件对StRab进行亚细胞定位预测，结果不尽相同。其中，PSORT 6.4的预测结果为：细胞质(cytoplasm)；SLP-Local的预测结果为：细胞核(nucleus)或细胞溶胶(cytosol)；Plant-mPLoc 和Euk-mPLoc 2.0的预测结果均为：内质网(Endoplasmic reticulum)，或高尔基体(Golgi apparatus)，或线粒体(Mitochondrion)，或细胞核(Nucleus)。那么，StRab究竟位于细胞何处？为明确StRab亚细胞定位，本研究通过洋葱表皮细胞瞬时表达系统进行分析。

2.6StRab亚细胞定位的试验分析

洋葱表皮细胞转化结果见图4。观察非转化的洋葱材料(图4-A、图4-B和图4-C均为阴性对照)和由空载体转化的洋葱材料(图4-D、图4-E和图4-F均为阴性对照)，在其细胞内未发现荧光分布，说明供试材料不同并不会对试验结果形成干扰，均可使用。观察经pBI121-gfp载体转化的洋葱材料(图4-G、图4-H和图4-I均为阳性对照)，发现其细胞内有GFP荧光分布，说明pBI121-gfp载体和洋葱材料均不影响GFP表达，方法可靠可行。观察经pBI121-StRab-gfp载体转化的洋葱材料(图4-J、图4-K和图4-L)，发现其细胞膜或细胞壁有GFP荧光分布，说明StRab蛋白可能定位于细胞膜或细胞壁，再经进一步质壁分离试验(图4-M、图4-N和图4-O)确认GFP荧光存在于细胞膜。说明StRab蛋白定位于细胞膜。

A、D、G、J、M. 明场下照片Bright light vision in left panels；B、E、H、K、N. 暗场下的荧光照片The GFP fluorescence in dark field vision in the middle of panels；C、F、I、L、O. 前2幅图的合成图Merged fluorescent signals in right of panels；在每行图片DEF、GHI、JKL、MNO前是与其相应的转化载体The vectors, before the images DEF, GHI, JKL, MNO, are their corresponding transformation vector；ABC前是空白，表明没有使用载体Blank, before the image ABC shows vector they did not use

图4洋葱表皮细胞瞬时转化试验

Fig.4Onion epidermal cells transient expression assay

3　讨 论

不同亚细胞定位软件的分析原理不同，分析结果存在一定差异，并且软件分析结果仅为预测性结果，不一定准确，因此必须通过试验加以确认，如拟南芥的乙烯受体ETR1[29]具有跨膜区域，与乙烯结合后可定位于细胞膜，但软件分析却未发现ETR1的跨膜标识。并且软件不能确定定位的具体位置，如软件分析PF40[30]可能定位于膜上，但具体定位于哪种膜，是核膜、细胞膜，还是叶绿体膜、线粒体膜，或者是内质网、高尔基体？尚不能给出明确结果，必须通过试验进一步证实。

本研究采用不同的亚细胞定位软件对StRab蛋白进行分析，结果不尽相同。通过洋葱表皮细胞瞬时转化试验分析显示，StRab蛋白定位于细胞膜。另外，PrePS软件分析发现，在StRab蛋白的C末端有1个转录后修饰位点CCSS，诸多研究[31-33]认为，此位点被修饰后可形成一个与细胞膜相连的疏水区，进而将StRab蛋白附着于细胞膜来执行相关功能。但StRab蛋白是否通过CCSS修饰定位于细胞膜，还需要进一步研究证实。

转化洋葱表皮细胞既可采用基因枪法，也可用农杆菌侵染法。这2种方法的结果存在一定差异，如农杆菌转化法定位的表达蛋白可能较集中，而基因枪法定位的结果可能较分散。但无论采用何种方法，均需要通过阴性对照和阳性对照来区别材料自发荧光与GFP荧光，以免得出错误结论。

植物在受到生物或非生物胁迫时，首先是细胞膜受到伤害。受伤的细胞膜可通过Rab蛋白控制的小泡运输进行修复，从而调节或适应胁迫[34]。本研究显示，StRab蛋白定位于细胞膜，提示其可能参与胁迫产生的胞吞或胞吐作用，但仍需进一步研究证实。

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(责任编辑：郭柏寿Responsible editor:GUO Baishou)

Analysis of StRab Protein Sequence Features and Subcellular Localization

GAO Wen1and XIE Conghua2

(1.College of Forestry,Henan University of Science and Technology,Luoyang Henan 471003,China;2.College of Horticulture and Forestry,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

To further explore the functional mechanism of StRab protein in stress response of potato,the bioinformatics analysis and onion epidermal subcellular location assay were conducted.The results of sequence analysis showed that nucleotide sequence of StRab is 889 bp,which 203 amino acids were encoded in coding region of 612 bp.The StRab was a stable,soluble,non-secretedand non-transmembrane protein.It contained all sequence features of the small GTP-binding protein family,and the C terminal CAAX motif.The StRab was fused with gfp for locating test,the results indicate that StRab is located on the cell membrane.Therefore,the StRab is a membrane attachment protein,and may play an important role in potato stress response.

Potato; StRab; Bioinformatics analysis; Subcellular localization

2016-01-01Returned2016-03-28

The Potato Industry Technology System (No.CARS-10-P06).

GAO Wen,male,Ph.D,lecturer.Research area:mainly engaged in biotechnology and breeding in potato.E-mail:tommoto@163.com

2016-01-01

2016-03-28

国家马铃薯产业技术体系(CARS-10-P06)。

高文，男，博士，讲师，从事马铃薯生物技术与繁育工作。E-mail：tommoto@163.com

S532；Q81

A

1004-1389(2016)08-1180-07

网络出版日期：2016-07-14

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160714.1103.018.html