霉菌利用纤维质原料产乙醇的研究进展

崔田田,张宝善,冯亚运,王金丹,林　敏

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119)



霉菌利用纤维质原料产乙醇的研究进展

崔田田,张宝善*,冯亚运,王金丹,林敏

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119)

利用霉菌发酵纤维质原料生产乙醇技术越来越受到人们的广泛关注。本文列出了具有潜在产乙醇能力的霉菌种类,介绍了有关霉菌代谢糖类物质的机理及霉菌产乙醇的特点,同时指出不同因素对霉菌发酵产乙醇的影响,这对探索霉菌利用纤维质原料制备乙醇新方法具有一定的指导意义。

纤维质原料,霉菌,乙醇

当前,能源危机已成为世界问题,利用微生物生产燃料酒精等生物能源被认为是解决能源问题的最有效、最能实现的方法之一。现在燃料酒精生产大多以糖类或淀粉质原料为原料,但产量受到粮食资源的限制,难以长期满足能源需求。人们在寻找新型原料时发现纤维质是一种良好的可再生替代源[1],部分微生物可利用纤维质发酵生产酒精和其他清洁燃料,如金花等人对Mucor indicus利用麦秆水解液发酵生产燃料乙醇进行了研究,结果表明M.indicus较酿酒酵母的显著优势在于不仅能利用秸秆水解液中的葡萄糖,而且也能利用其中的木糖产生乙醇[2]。纤维质原料主要包括农作物秸秆、林业加工废料、甘蔗渣及城市垃圾中所含的废弃生物质等[3]。一直以来,酵母被认为是生产乙醇的常用菌种,但酵母菌不能将纤维质原料水解成木糖,并将其转化为酒精,限制了其在纤维素乙醇领域的利用。细菌也能进行酒精发酵,但它们在产乙醇的同时还会产生副产物,致使乙醇的转化率较低,经济成本很高[4]。霉菌属微生物利用纤维质原料也能产酒精,但很少受到关注,这是因为霉菌在传统上被认为是好氧菌属,需在有氧条件下生长,而酒精发酵是厌氧过程[5]。其中选用合适的菌种发酵纤维素生产酒精对工业化应用极为重要[6]。现有研究发现部分霉菌具有直接把纤维素转化为乙醇的能力,这就为我们在同一个生物反应器中,利用同一种微生物完成酶水解纤维质原料成多糖并发酵成酒精的全过程,从而为简化工艺、降低成本提供了可能[7]。

本文综述了霉菌利用纤维素原料转化为酒精的研究进展,列举了几种具潜在发酵酒精能力的霉菌种类,介绍了霉菌发酵糖类物质的机理、霉菌产酒精的特点以及影响其酒精发酵的因素,同时提出了目前霉菌产酒精存在的问题,并对其未来的应用进行了展望。

1　产酒精的霉菌种类

霉菌一般可在较高温度下生存,且其产酒精经常伴随着有氧菌丝生长及无氧发酵两个阶段,且霉菌可利用多种糖类物质尤其是酵母所不能利用的戊糖类,部分霉菌可将纤维素类物质直接转化为酒精。有报道能产乙醇的霉菌包括尖镰孢菌(Fusarium)、根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)、粗糙脉孢菌(Neurospora)、念珠菌属(Monilia)、拟青霉属(Paecilomyces)、和曲霉属(Aspergillus)等。

表1　产乙醇霉菌种类及其特点

Lubbehusen等人研究了Mucorcircinelloides采用液态深层分批发酵方式,利用多种碳源产酒精的情况,结果表明M.circinelloides在不限氧条件下可利用葡萄糖产生酒精,而其转化半乳糖及木糖产酒精能力相对较弱[8]。Goshadrou等人采用Mucorhiemalis作为发酵菌种对不同预处理的甘蔗渣进行发酵,其中利用碱液辅助超声破碎法处理后的甘蔗渣水解物M.hiemalis具有较高的酒精转化率,发酵24h酒精产率达到0.70g/L(h[9]。美国人Stevenson在农场的奶牛尿中分离出一株菌,在厌氧的条件培养,能直接将纤维素发酵成酒精,产量为0.4g/L,经鉴定此菌株为木霉[17]。张志华对N.crassa AS3.1602好氧产酶和厌氧直接发酵产生酒精的过程进行了代谢分析,以20g/L的微晶纤维素为碳源进行产酶培养,好氧发酵3d时菌体处于稳定期,所产生的酶活性都处于较高水平。厌氧条件下直接转化20g/L的微晶纤维素,发酵96h时酒精浓度可达到6.3g/L[18]。Gong等人发现Monilia sp.能够将高于70%的滤渣和60%的微晶纤维素转化为酒精,并且乙醇产量分别达到16、12g/L[21]。研究表明Monilia sp.还可以利用半纤维素及果胶,由于农业残渣的主要成分是半纤维素因而提高了该菌种工业化应用的潜在能力。表1列出了可以产乙醇的霉菌种类及其特点。

2　霉菌转化纤维质产乙醇的机理

霉菌可利用纤维质降解的糖类物质如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等生产乙醇。到目前为止,关于霉菌直接将纤维素转化为酒精的报道很少,而F.oxysporum[10]和N.crassa[18]被发现具有将水解和酒精转化过程同时进行的能力。

利用微生物转化纤维质原料产乙醇的步骤有两步[6]:纤维素水解成可发酵性糖,微生物将可发酵性糖转化为酒精。有关微生物代谢葡萄糖产生酒精的机制已经很清楚,霉菌和酵母菌是通过EMP途径将葡萄糖转化为酒精。EMP途径大致可分为两个阶段:第一阶段只是生成两分子的主要中间代谢产物3-磷酸-甘油醛;第二阶段发生氧化还原反应,释放能量合成ATP,同时形成两分子的丙酮酸。理论上1g葡萄糖可产生0.51g乙醇和0.49g CO2,乙醇及CO2产生实际值分别为0.46、0.44g,因为有0.1g的葡萄糖转化为生物质。尽管微生物自身代谢机制可以促进葡萄糖进入细胞,但糖代谢过程影响因素很复杂,目前还没完全被大家所熟知。在酵母属中发现两条主要的抑制葡萄糖代谢因素包括巴斯德效应及葡萄糖效应。

对于利用木糖代谢,第一步要将木糖转化为木酮糖,细菌可直接利用木糖异构酶将木糖转化为木酮糖,而对于拟青霉属,在戊糖代谢初始阶段中会检测到一系列的酶,这些酶常见于酵母属和霉菌属。在该氧化还原途径中,木糖首先在NAD(P)作为辅酶的木糖还原酶作用下变为木糖醇,接着在木糖醇脱氢酶作用下重新氧化成木酮糖[22]。该氧化还原途径已被证明存在于大多数常见的霉菌中,本过程中涉及到的木糖还原酶及木糖醇脱氢酶具有可诱导性,并且专一作用于D-木糖及木糖醇,但细菌中的木糖异构酶不具有可诱导性。在木糖转化为木酮糖后,由D-木酮糖磷酸化生成D-木酮糖-5-磷酸,之后进入磷酸戊糖途径,以中间产物葡萄糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸进入EMP途径,最终在厌氧条件下生成乙醇,如图1。戊糖代谢途径远比己糖代谢复杂,这也是霉菌利用戊糖产酒精较己糖低的原因。

图1　霉菌利用单糖代谢途径Fig.1　Pathway for monosaccharide catabolismin filamentous fungi

3　霉菌发酵产乙醇的特点

3.1同步糖化和生物转化

纤维质经微生物转化为乙醇的传统工艺主要包括两步:首先在酶解糖化作用下将多糖降解为单糖;其次将单糖转化为乙醇。为了提高工业效率,有研究者采用不同的纤维素酶产生菌与酒精发酵菌种共同培养,使酶解与产酒精过程在同一反应器中进行。采用同步糖化发酵法可以缓解终产物抑制作用,因为水解后产生的葡萄糖在该系统中可以很快转化为乙醇。

F.oxysporum因其具有产多糖酶及发酵糖类物质产酒精能力而使它成为同步糖化与生物转化的理想菌种。Panagiotou等人将F.oxysporumF3置于30℃,pH6的培养液中孵育72h,该阶段为菌种的生长产酶期,通过调节搅拌速率将氧浓度控制在30%;之后将菌种接入浓度为20g/L的纤维素浆液中进行厌氧发酵。结果表明F.oxysporumF3在纤维素基质中最大比生长速率达到0.023h-1,且产内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶及纤维二糖酶活性分别为55、1.25、0.43U/mL,其发酵纤维素生成乙醇得率为0.35g/g[23]。近年来,Zerva等人实验证明Paecilomycesvariotii可将葡萄糖、木糖转化为乙醇,即使在有葡萄糖存在时仍优先利用木糖,该菌种不仅能产生可降解纤维素的酶,并能将水解底物转化为乙醇,且最大乙醇产量接近理论值[24]。

表2　不同种类真菌产纤维素酶及木聚糖酶活性的比较[18]

3.2直接生物转化纤维素原料

霉菌直接将纤维素原料生物转化是一项极具潜力的产乙醇方法,原因在于仅利用单一菌种即可将基质的有氧水解和半厌氧条件下的乙醇发酵过程同时进行,既可产生水解酶又能进行酒精发酵。

3.2.1多糖酶的产生纤维素酶是一种多组分的复合酶,现已确定纤维素酶含有3种主要组分,即内切葡萄糖苷酶(EC3.2.1.4)、外切葡萄糖苷酶(EC3.2.1.91)和纤维二糖酶(EC3.2.1.21)。在纤维素水解过程中首先由内切葡萄糖苷酶在纤维素链内部水解,降低其聚合度,然后由外切葡萄糖苷酶作用于非还原性末端释放出纤维二糖;最后由纤维二糖酶将纤维二糖水解为葡萄糖。有多种微生物能够产生纤维素酶,例如细菌、放线菌、丝状真菌、粘细菌、担子菌和其他高等形式软体动物等。研究发现,某些微生物可以合成纤维素酶,但无法将水解得到的糖转化为酒精。而某些微生物可将蔗糖转化为酒精,但却不能合成能够水解纤维素的多糖酶。只有极少一部分丝状真菌既能水解多糖又可以将水解产物转化为酒精,如表2所示。

Gong等人从甘蔗渣中分离的Moniliasp.可以利用多糖包括纤维素产生酒精,并产生纤维素酶及木聚糖酶。在菌种培育48h后可以检测到纤维素酶的活性,当纤维素作为发酵基质时,可以检测到纤维素酶和木聚糖酶的活性[21]。有研究发现链霉菌属(Streptomyces)在木聚糖作为碳源时也可以产生木聚糖酶,但木聚糖不是它们产生木聚糖酶所必需的,因为在纯纤维素或葡萄糖作为碳源时检测到高活性的木聚糖酶[25]。在同步发酵中,酒精对纤维素酶产生非竞争性抑制,而产酒精霉菌所产生的纤维素酶在整个生物转化过程中都保持其稳定性。

3.2.2乙醇的转化由于纤维素直接发酵法生产乙醇具有工艺简单,历时短,有望大幅度降低产酶成本以及纤维素乙醇生产总成本,近二十年来该项技术研究受到了国内外学者的广泛重视,有研究者报道了以嗜温细菌(Clostridiumthermocellum)和C.thermohydrosulfuricum以及丝状真菌N.crassa,Moniliasp.和F.oxysporum进行纤维素直接发酵生产乙醇[26]。

4　影响霉菌产乙醇的因素

4.1通气量

研究发现大部分霉菌在有氧情况下生长,在半厌氧状态下产乙醇。通气量对霉菌利用基质中的碳源及最终乙醇的转化量具有重要影响,乙醇积累只发生在低氧条件下。在缺氧情况下,霉菌生长受到限制,随着氧气的限制量增加,乙醇的积累量表明氧气利用率是决定乙醇产量的一个重要因素。随着氧气限制的增加,菌体生长能力减弱,而乙醇产量逐渐增加。

Dogaris等人研究发现N.crassa产乙醇的两个阶段为:有氧生长阶段,粗糙脉孢菌在有氧条件下生长,逐渐产生纤维素酶及半纤维素酶;厌氧发酵阶段,将菌种由生长瓶转移至特制锥形瓶中,该瓶顶部装有针孔橡胶塞以降低氧气的渗入同时排出CO2,该装置同样适用于F.oxysporum[27]。Lubbehusen等人研究发现卷枝毛霉不仅可以在完全厌氧条件下生长,并且能够在葡萄糖过量时有氧条件下产生乙醇[28];Kurakov等人从不同地区筛选出多株霉菌在厌氧条件下利用葡萄糖发酵生产酒精,其最大生产量达到2.5%～4.7%,几乎接近于酵母属发酵生产酒精量[29]。Karimi等人发现在基质葡萄糖浓度高于30g/L无氧条件下培养有助于提高M.indicus产生酒精量[30],另外由于M.indicus具有形态二相性,孢子浓度的大小以及所处环境中氧气的含量都会对该菌形态产生一定的影响[31]。

Rasika等人研究白腐菌Trametes versicolor在完全缺氧及低氧含量两种条件下利用木糖与己糖混合物发酵产乙醇,结果表明T.versicolor低氧条件下发酵354h后酒精转化率达到最大20g/L,而完全厌氧条件下未检测到乙醇的产生[32]。Xiros和Christakopoulos以树胶醛糖∶木糖∶葡萄糖(1∶2∶1)混合糖作为发酵基质,在通气率分别为0、0.1、0.2及0.4vvm时观察F. oxysporum利用混合糖产乙醇的情况。结果显示在所有通气条件下,乙醇产量72h时达到最大,而在完全厌氧条件下乙醇转化较慢,120h后乙醇量才达到最大值;当通气率为0.1、0.2 vvm,发酵72h后基质中检测不到木糖,而在完全缺氧条件下F. oxysporum对木糖的吸收较慢,这说明少量通气对F. oxysporum利用木糖发酵产乙醇是极为必要的[33]。由此可见通气量是影响霉菌生物转化乙醇的一个重要因素,通过调节气体比例可获得较高产量的乙醇。

4.2碳源

到目前为止,生产乙醇主要采用传统的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),然而Saccharomycescerevisiae并不能很好的适用于木质纤维原料的发酵,它只能发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖,不能转化半纤维素中的戊糖。由于在木质纤维素原料中存在大量的半纤维素,所以这一点限制了酵母菌的应用[1]。

研究发现部分霉菌可产生降解纤维素酶,并将水解产物中的所有糖类物质转化为乙醇。N.crassa是一种能够利用多种碳源包括纤维素、木糖、树胶醛糖、甘露糖、半乳糖以及葡萄糖生产酒精的霉菌,该菌种现以被广泛应用于基因学、生物化学以及分子生物学[34]。Dogaris等人采用经稀酸前处理的甘蔗渣,分别以N.crassa、S.cerevisiae以及二者混合菌种作为发酵菌,结果表明N.crassa乙醇转化能力高于S.cerevisiae,混合菌种发酵反而降低了乙醇产量[27]。另外,Paecilomycessp.NF1也可以利用多种糖作为碳源产生乙醇,Zhang等人通过研究发现P.chrysosporium是目前利用木糖产生乙醇量最大的菌种,产酒精量可高达73g·L-1/200g·L-1木糖,且只产生痕量的其他副产物[35]。

Sharifia采用M.indicus作为发酵菌种,分别利用不同的糖类物质作为碳源,结果表明M.indicus可以利用糖浆中的葡萄糖、果糖产生乙醇,而不能直接利用蔗糖发酵产生酒精[14]。Millati 等人对Rhizopus,Rhizomucor,及Mucor分别利用葡萄糖、木糖和稀酸水解物作为碳源进行乙醇发酵,结果表明其中两株毛霉M.hiemalis和M.indicus产酒精量较高,其他菌种代谢除产生乙醇外,还会产生乳酸、丙三醇等副产物[36]。Colabardini 等人将A.nidulans的木糖转运蛋白基因导入酵母属进行表达,提高了酵母属对戊糖的利用率[37]。Rasika等人用Trametesversicolor发酵木质素降解的己糖和木糖,结果表明在以己糖和木糖单独作为碳源时产酒精量分别为20.0、9.02g/L,当葡萄糖与木糖等比例时,总糖发酵产乙醇可达到80%[32]。

4.3氮源

有关氮元素对霉菌的生长及代谢的影响已经为大家熟知,铵离子可以通过ATP抵消对磷酸果糖激酶的抑制作用,进而促进糖酵解,其还可以刺激微生物生长,降低细胞内的NADH水平,阻遏6-磷酸葡萄糖脱氢酶,从而促进了磷酸戊糖途径的进行。很多学者对一系列的有机氮和无机氮进行了研究,如表3所示,Asachi等人利用M.indicus的菌体自溶物代替酵母膏,结果显示当添加菌体自溶物10g/L时,乙醇得率为0.47g/g,产率达到0.71g/L·h,相比于添加酵母膏的乙醇得率及产率分别为0.45、0.67g/L·h,乙醇产量明显提高[33]。

表3　霉菌生物转化过程中利用的含氮化合物[39]

Zerva和Savvides采用尿素、NaNO3、NH4NO3、(NH4)2HPO4、(NH4)2SO4、蛋白胨及酵母膏作为氮源,以Paecilomyces variotii为发酵菌种利用等浓度葡萄糖、木糖作为发酵基质,结果表明以硝态氮作为氮源产乙醇量明显较高[16]。

4.4矿物质及维生素

有关矿物质及微量元素对微生物代谢物的生物合成影响早有报道,但对霉菌产酒精的影响鲜有研究。有研究发现微量元素如Fe、Zn、Cu和Mn可以促进Polyporusanceps的生长,而钴在浓度为1～100mg/L时产生毒性,钼对霉菌生长基本无影响。另外发现,硫胺素对P.anceps的生长起着至关重要的作用,随着基质中硫胺素浓度的增加,菌丝的重量增加,同时葡萄糖消耗量及乙醇产生量也随之增加[40]。Marzieh等人研究了磷酸盐对M.indicus产酒精量的影响,在基质中添加0.5g/L的KH2PO4,不仅提高了葡萄糖胺的产量,同时也增加了乙醇产量[41]。

4.5接种期

接种期是影响纤维质转化为乙醇的一个重要因素,研究发现将菌种在营养液中摇床培养一段时间后获得菌体悬浮液接种至发酵基质,相比于直接从琼脂斜面中获得的菌体,前者所产生的乙醇量明显较高。Goshadrou等人在研究M.hiemalis利用甘蔗渣发酵产乙醇情况时,前期要进行接种准备,主要包括在营养琼脂上的活化以及在合适条件下进行摇床培养以获得孢子悬浮液,之后接种至发酵基质中进行发酵[9]。另外,接种量会通过改变生物过程的延迟期,进而影响发酵过程中的乙醇产量。Molaverdi等人研究了不同接种量对M.indicus固态发酵高粱秸秆产酒精的影响,当初始菌种浓度为0.001、1及5g/L对乙醇发酵的影响表现为随着浓度的增加,乙醇产量也随之增加[42]。Dogaris等人在利用N.crassa将高粱渣转化乙醇实验中,将菌种在有氧条件下培养48h后获得高浓度孢子悬浮液,取一定量的孢子液接入高粱渣水解液中,结果表明随接种量的增加,酒精产生量也增加[27]。

4.6pH

最初学者们选取霉菌发酵产酒精的pH一般为5.0～6.0,Xiros和Christakopoulos利用F.oxysporum产乙醇最适pH为5.5,而当pH为6.0时,会产生较多的乳酸[33];N.crassa产乙醇最适pH范围在5～6之间,这也是纤维素酶作用的最适pH[28];Paecilomycessp. NF1发酵最适pH范围较广,当pH在2.2～7.0时,可产生相同量的乙醇[16];而对于F.oxysporumF3,pH对其酒精产量的影响,在有氧和无氧情况下,最适pH分别为5.5和6.0。有氧条件下,低pH会导致酒精产量下降,因而调整最初pH在最适条件下既有利于β-葡萄糖苷酶的活性又有利于乙醇的产生[23]。

4.7温度

乙醇发酵温度一般在25～37℃,如表4所示,研究发现不同菌种的最佳发酵温度不一致。N.crassa利用葡萄糖发酵生产乙醇时的最适温度为28～37℃,而其利用纤维质原料发酵产乙醇时的最佳温度为37℃,该温度下90%的纤维素在4天后转化为乙醇[28]。同样,Paecilomycesp.发酵最适温度范围是30～37℃[16],而M.indicus发酵高粱秸杆产乙醇最适温度为32℃[42]。

表4　霉菌产乙醇的最适温度及pH

5　霉菌产乙醇存在问题及展望

利用霉菌以纤维质原料生产乙醇是缓解化工原料消耗的一种有效手段,具有成本低、生产设备简单以及可再生性等优点,对未来燃料酒精的生产发展具有无限潜力。但目前利用霉菌生产酒精仍未投入工业化生产,原因在于该方法生产酒精仍存在一些问题:第一,纤维素生物质中除了含有大量的纤维素外,还有大约20%～30%的半纤维素,而半纤维素水解成分组成中含有五碳糖(主要为木糖),霉菌利用木糖发酵酒精的效率仍相对较低。第二,半纤维素经预处理和水解过程后还产生了小分子酸、醛类、酚类等发酵抑制剂,更加大了发酵难度。第三,所采用的同步糖化发酵法还存在一定的缺点,例如最佳的水解和最佳的发酵需要不同的温度,最佳水解温度为45～50℃,而最佳的发酵温度为28～35℃。SSF常在35～38℃下操作,这一折中处理使酶的活性和发酵的效率都不能达到最大[44]。

到目前为止,尽管还没找到完全令人满意的将纤维质转化为乙醇的菌种,但利用一些霉菌将纤维素、淀粉以及戊糖转化为酒精仍给生产化工原料带来了经济效益。此外,通过对比不同因素对霉菌发酵乙醇的影响可知,严格控制通气量相较于其他因素对乙醇产量的影响显著,因而需在进一步工业化生产乙醇产业中通过调节气体比例以提高酒精产量。目前生产燃料酒精是以玉米为原料,但原料成本占总成本的70%～80%。纤维素是地球上最丰富、最廉价可再生资源,因此研究开发纤维素转化技术,将秸秆、蔗渣、废纸、垃圾纤维等纤维素类物质高效转化为糖,进一步发酵成乙醇,对开发新能源,保护环境,具有非常重要现实意义。

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Advances in bioconversion of cellulosic materials to ethanol by moulds

CUI Tian-tian,ZHANG Bao-shan*,FENG Ya-yun,WANG Jin-dan,LIN Min

(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China)

Ethanol production,using cellulosic materials by moulds,has been paid more and more attention. The recent development of the ethanol production from cellulosic materials has been reviewed,including the potential fungal strains,the carbohydrate metabolism in moulds,the characteristics of ethanol producing moulds and the factors affecting ethanol production,in this paper,which has a certain guiding significance for exploring a new method to produce ethanol from cellulosic materials by moulds.

cellulosic materials;moulds;ethanol

2014-10-27

崔田田(1990-)，女，在读硕士，主要从事食品发酵与质量控制研究。

张宝善(1968-)，男，教授，副院长，主要从事于食品微生物学、食品发酵学、果蔬加工学的教学、科研与生产服务工作。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000