自体DC-CIK细胞治疗晚期实体瘤患者的疗效分析

冉宝石，王 伟，王 刚，孙玉蓓，王保龙，季楚舒



自体DC-CIK细胞治疗晚期实体瘤患者的疗效分析

冉宝石，王 伟，王 刚，孙玉蓓，王保龙，季楚舒

目的 研究树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞（DC-CIK）治疗对晚期肿瘤患者免疫系统影响及临床疗效。方法 选取60例患者，分为两组，试验组行两周期DCCIK治疗，对照组未治疗，对比试验前后外周血免疫细胞比例及生活质量变化，观察疗效及不良反应。结果 试验组总缓解率为0，疾病控制率约36.67%，外周血CD4+T细胞、自然杀伤细胞（NK）及CIK细胞比例较前升高（P＜0.05），CD8+T细胞比例下降（P＜0.05），患者生活质量较前改善，不良反应为低热、过敏等；对照组CD4+T细胞、NK细胞及CIK细胞比例较前下降（P＜0.05），而CD8+T细胞比例升高（P＜0.05），患者生活质量较前下降。两组B细胞比例均无明显变化。结论 DC-CIK可改善晚期实体瘤患者免疫功能和一般状况，在临床治疗中有一定疗效，且副作用小，可作为放化疗失败后的选择之一。

树突状细胞；细胞因子诱导的杀伤细胞；晚期实体瘤；淋巴细胞亚群；生活质量

网络出版时间：2016-6-6 13：52：32 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.062.html

树突状细胞（dendritic cells，DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells，CIK）免疫治疗作为继手术、化疗、放疗及靶向治疗之外的另一肿瘤治疗方法，不仅可以抑制或杀伤恶性肿瘤，还有助于恢复患者自身免疫系统，提升抗肿瘤能力，其良好的疗效得到临床广泛认可［1-2］。DC细胞通过识别抗原激活获得性免疫系统，而CIK细胞则通过自身细胞毒性及分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞，二者联合培养的DC-CIK细胞有更强的增殖活性和抗肿瘤活性［3-4］。针对晚期肿瘤患者，常因病期较晚、患者身体状况较差、历经多种常规治疗后病情仍然进展等难题缺乏行之有效的治疗手段，DC-CIK免疫治疗的出现为这类患者带来了新的曙光。该试验拟研究DC-CIK治疗晚期肿瘤患者的临床疗效、免疫作用、对生活质量的影响以及治疗的不良反应。

1　材料与方法

1.1病例资料 入选标准：①经病理学确诊，并根据国际抗癌联盟（UICC）制定的TNM分期标准划分为Ⅳ期的恶性实体瘤患者；②既往行手术、放疗、一二线化疗或介入治疗后效果不佳或无法耐受上述治疗的患者；③KPS评分≥60分，预计生存期＞3个月；④除外合并严重心、肝、肾功能不全，造血系统和其它免疫系统疾病，哺乳或怀孕妇女，精神病患者。

随机选取2014年1月～2015年3月就诊于安徽医科大学附属省立医院肿瘤化疗科的60例晚期肿瘤患者，病种包括肾癌20例，恶性黑色素瘤20例，胃癌4例，食管癌4例，结直肠癌4例，卵巢癌4例，输尿管癌2例，子宫内膜癌2例，多伴有肺、肝、骨、腹腔或腹膜后淋巴结转移。各病种患者平均分成试验组及对照组，每组各30例，其中试验组男20例，女10例，年龄（63.27±11.27）岁；对照组男22例，女8例，年龄（60.26±14.63）岁，组间差异无统计学意义。患者均符合入组标准，试验组的DC-CIK治疗已获得医学伦理委员会批准，均被告知相关治疗风险并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1DC培养 采用血细胞分离机分离出患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），Ficoll密度梯度离心法提取淋巴细胞，充分洗涤，BTN无血清培养液混悬于8张6孔培养板，置于37.5℃、5%CO2培养箱中贴壁培养2 h。将悬浮细胞与疏松贴壁细胞分离，贴壁细胞用粒细胞巨噬细胞刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）、肿瘤坏死因子α（tumor nectosis factoralphagene，TNF-α）按一定比例及顺序诱导分化，定期观察细胞长势并及时补充培养液和细胞因子，同时检查有无细菌、真菌及支原体感染。

1.2.2CIK细胞培养 将上述采集的悬浮细胞使用含一定比例的CD3单克隆抗体、IFN-γ、IL-2、患者自体灭活血清、灭活小牛血清、庆大霉素的BTN无血清培养液，37.5℃、5%CO2培养箱培养，定期观察细胞长势并补充培养液及细胞因子，同时检查有无细菌、真菌及支原体感染。

1.2.3DC与CIK细胞共培养 将培养4 d后的DC与CIK细胞共培养，按1∶10比例混合，采用CIK细胞的培养环境，4 d后检查有无细菌、真菌及支原体感染。

1.3细胞回输 细胞培养成熟后，经细菌、真菌、支原体检测为阴性，且台盼蓝染色活细胞＞95%时，采集DC-CIK细胞，生理盐水洗涤3次，加入含患者自体灭活血清的生理盐水中，以细胞数为（1～3）× 109/次静脉回输。

1.4临床疗效观察内容 试验组：患者两个疗程DC-CIK细胞回输后行疗效评估及不良反应评价，治疗前后用流式细胞术行外周血T、B、NK细胞亚群及CD3+CD56+细胞亚群测定等，EORTC-QLQ量表评估患者生活质量变化。对照组：采取试验前后随访并抽取部分外周血行细胞亚群检测，同时填写EORTC-QLQ量表。

1.5疗效评价指标 对实体瘤患者采用RECIST疗效评价标准，主要以CT、MRI、超声等检查对病灶行2周期评效。① 完全缓解（complete remission，CR）：所有目标病灶消失；② 部分缓解（partial remission，PR）：病灶长径总和缩小≥30%；③肿瘤稳定（stable disease，SD）：病灶长径总和有缩小但未达PR或有增加但未达（progression disease，PD）；④PD：病灶长径总和增加≥20%或出现新病灶。CR与PR所占百分比为客观缓解率（objective response rate，ORR），CR、PR、SD所占百分比为疾病控制率（disease control rate，DCR）。

1.6统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行分析，定量资料免疫细胞比例采用中位数M表示，检验采用自身配对的Wilcoxon符号秩和检验；生活质量EORTC-QLQ量表以±s表示，检验采用配对样本均数的t检验，两种检验均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1疗效评价及不良反应 根据RECIST评效标准，试验组患者中CR为0例，PR为0例，SD为11例（36.67%），PD为19例（63.33%），ORR为0.00%，DCR约36.67%。SD患者中部分肿瘤标志物出现下降，PD患者的肿瘤标志物均为上升。对照组未能配合完成影像学评估，根据随访和患者临床表现推断整体病情进展。治疗的不良反应主要为回输后1～6 h内出现体温升高，最高温度为37.2℃，可自行降至正常，例数为10例，约占33.3%；有1～3例出现失眠、头晕等现象，另有1例在回输第2疗程中出现颈胸处过敏现象（既往无此类过敏史），对症处理后好转。

2.2细胞亚群变化 试验组患者均进行两疗程的DC-CIK治疗，患者治疗后外周血中 CD3+CD4+T细胞比例增加，CD3+CD8+T细胞比例降低，CD4+/ CD8+T细胞之比增大，CD3-CD16+CD56+NK细胞、CD3+CD56+细胞比例增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。CD3-CD19+B细胞比例、CD3+CD56-细胞比例较治疗前略降低，但差异无统计学意义。见图1、表1。对照组患者外周血中 CD3+CD4+T细胞、CD3-CD16+CD56+NK细胞、CD3+CD56+细胞比例较前下降，而CD3+CD8+T细胞比例升高，差异有统计学意义。CD3-CD19+B细胞比例无明显变化。见图2、3，表1。

图1　DC及CIK细胞培养前后的形态学变化×400

2.3生活质量变化 试验组患者生活质量变化通过EORTC-QLQ评分量表评估，该评分量表主要用于恶性肿瘤患者生活质量测定，除总健康情况得分与生活质量成正比外，其余项目均与生活质量成反比。将患者治疗前后评分汇总后进行统计分析，可以看出患者治疗后生活质量在角色/认知/社会功能、总健康状况、恶心呕吐、气促、失眠、便秘、腹泻方面有所改善（P＜0.05，P＜0.01）。对照组患者试验后角色/社会/认知功能、总健康状况、恶心呕吐、气促、失眠、腹泻、便秘等方面较前恶化，差异有统计学意义，其余各项差异均无统计学意义。见表2。

3　讨论

恶性肿瘤是一种全身性疾病，人体对肿瘤细胞的防御以T淋巴细胞介导的细胞免疫为主，而肿瘤细胞可通过MHC-Ⅰ/Ⅱ表达缺失、削弱APC的抗原提呈功能等不同途径进行逃逸［5］。DC-CIK细胞可在一定程度上阻断上述逃逸过程，增强机体特异性及非特异性杀瘤效应，从而使患者病情得到控制，生活质量改善［6］。

DC-ClK细胞治疗已成为肿瘤治疗的新兴辅助手段之一。DC-ClK治疗主要作用机理为：①DC作为体内功能最强的APC，将肿瘤抗原呈递给Th细胞（T helper cells，Ths），而肿瘤细胞可抑制DC功能，晚期肿瘤患者体内DC数量减少更为显著［6-9］，故增加患者体内DC细胞数量可提升自身免疫；②CIK细胞即为CD3+CD56+细胞，回输后患者体内所占比例明显增加。肿瘤细胞通过降低Fas表达逃避免疫细胞攻击，而CIK细胞则通过分泌大量细胞因子、启动caspase级联反应增加CIK细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用［10］。本研究显示，通过两周期DCCIK治疗后评效，患者临床获益率有36.67%，说明免疫治疗可使病情稳定，同时观察到治疗后患者疼痛、疲倦感减轻，总体健康状况得到改善，故DC-CIK在晚期放化疗失败后患者的治疗中有较好的应用价值。

图2　DC-CIK治疗前后各细胞亚群表达

图3　对照组试验前后各细胞亚群比例变化

T细胞包括CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞，其中CD3+CD4+T细胞又称Th细胞，可被APC表面的MHC-Ⅱ递呈的多肽抗原激活，从而促进CD8+T细胞分化为细胞毒T细胞（cytotoxic T cell，CTL），同时促进B细胞增殖分化，调节体液免疫，而肿瘤细胞可产生活性物质抑制T细胞增殖。本试验显示患者回输后外周血中Th细胞中位数由38.00%增加为50.40%，差异有统计学意义；CIK细胞兼具T细胞和NK细胞活性，患者回输后其细胞比例中位数由3.75%增加至4.50%，差异有统计学意义；NK细胞是机体重要的免疫监视细胞，介导天然免疫应答，能直接杀伤肿瘤细胞，也可发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，刺激后可分泌IFN-γ、THF-α等细胞因子，其数值高低可作为机体抗肿瘤能力强弱的指标之一。患者行DC-CIK细胞治疗后，外周血中 NK细胞比例较前增加，机体抗肿瘤能力提高。患者回输后出现的不良反应主要为体温升高、过敏，可能因为免疫细胞在体内释放大量白介素、干扰素［11］，另外Th细胞突然增加，Ts细胞比例降低，使机体免疫反应过强所致［12］，以上不良反应经对症处理后好转。

表1　患者治疗前后外周血免疫细胞亚群比例变化（中位数M）

表2　患者治疗前后EORTC-QLQ评分变化（±s）

表2　患者治疗前后EORTC-QLQ评分变化（±s）

评价内容　对照组（n=30）试验前　试验后　P值试验组（n=30）治疗前　治疗后　P值躯体功能　2.38±0.85　2.62±0.70　0.156　2.18±0.95　1.73±0.93　0.625角色功能　2.42±0.79　2.58±0.72　0.020　2.48±0.95　1.88±0.88　0.013情感功能　2.19±0.54　2.43±0.69　0.158　1.62±0.59　1.29±0.38　0.069认知功能　2.43±0.76　2.67±0.75　0.055　2.03±0.86　1.73±0.89　0.000社会功能　2.72±0.60　3.02±0.61　0.004　2.55±0.80　2.28±0.84　0.000总体健康状况　4.23±1.00　3.47±1.17　0.023　4.05±1.13　5.55±0.99　0.025疲乏　2.71±0.64　2.89±0.72　0.058　2.46±0.83　1.51±0.62　0.097恶心/呕吐　1.65±0.66　1.88±0.67　0.004　1.63±0.61　1.12±0.28　0.011疼痛　2.18±0.86　2.48±0.85　0.095　2.02±1.01　1.28±0.50　0.119气促　1.93±0.87　2.17±0.79　0.000　2.07±1.08　1.53±0.73　0.002失眠　2.67±0.88　3.03±0.81　0.000　2.47±0.97　1.60±0.67　0.010食欲丧失　2.70±0.84　3.00±0.83　0.000　2.57±1.07　1.43±0.63　0.106便秘　1.27±0.52　1.13±0.35　0.001　1.63±0.81　1.13±0.35　0.004腹泻　1.57±0.68　1.57±0.73　0.000　1.57±0.68　1.13±0.35　0.000

本研究还表明DC-CIK治疗后患者体内的CD8+T细胞比例降低，平均由32.50%降至21.40%，差异有统计学意义。分析此现象机理如下：在T细胞活化过程中，需要有协同刺激分子B7家族的参与，后者若与T细胞表面的CD28识别可产生正性第二信号，使T细胞活化增殖，而与T细胞表面的CTLA-4结合则产生负性第二信号，抑制T细胞发挥免疫作用，因此CD8+T淋巴细胞既可成为CTL，也可成为抑制性T细胞（Ts）。肿瘤细胞中往往缺乏共刺激信号B7分子，当其处于低水平时，与CTLA-4的结合占优势［13-14］，故肿瘤患者外周血中CD8+细胞可能以Ts为主，Ts抑制了细胞及体液免疫功能。恶性肿瘤患者外周血中Th细胞减少，而Ts细胞增多，这一趋势随病情恶化而加重，是肿瘤患者细胞免疫功能低下的原因之一［15-16］。通过DC-CIK细胞治疗，患者机体免疫力提高，Th/Ts比例增高，抗肿瘤作用增强，可以用上述理论进行解释。但因纳入样本量较小，病种多元化，检测的免疫指标较少，故上述结论及相关的免疫学机制仍需要在后续研究中进一步验证和探索。

综上所述，本研究提示自体DC-CIK回输治疗可一定程度上改善患者免疫系统功能，抑制肿瘤细胞生长，提高疾病控制率及患者生活质量，且治疗不良反应较小，对既往多种治疗方法疗效不佳或无法耐受的晚期实体瘤患者可以尝试。

［1］Shi S B，Ma T H，Li C H，et al.Effect of maintenance therapy with dendritic cells：cytokine-induced killer cells in patients with advanced non-small cell lung cancer［J］.Tumori，2012，98（3）：314-9.

［2］Yang L，Ren B，Li H，et al.Enhanced antitumor effects of DC-activated CIKs to chemotherapy treatment in a single cohort of advanced non-small cell lung cancer patients［J］.Cancer Immunol Immunother，2013，62（1）：65-73.

［3］Zhao Y J，Jiang N，Song Q K，et al.Continuous DC-CIK infusions restore CD8+cellular immunity，physical activity and improve clinical efficacy in advanced cancer patients unresponsive to conventional treatments［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2015，16 （6）：2419-23.

［4］Qu H Q，Zhou X S，Zhou X L，et al.Effect of DC-CIK cell on the proliferation，apoptosis and differentiation of leukemia cells ［J］.Asian Pac J Trop Med，2014，7（8）：659-62.

［5］de Aquino M T，Malhotra A，Mishra M K，et al.Challenges and future perspectives of T cell immunotherapy in cancer［J］.Immunol Lett，2015，166（2）：117-33.

［6］Anguille S，Smits E L，Lion E，et al.Clinical use of dendritic cells for cancer therapy［J］.Lancet Oncol，2014，15（7）：e257 -67.

［7］Kawakami Y，Fujita T，Kudo C，et al.Dendritic cell based personalized immunotherapy based on cancer antigen research［J］. Front Biosci，2008，13：1952-8.

［8］Ye F，Yu Y，Hu Y，et al.Alterations of dendritic cell subsets in the periphera circulation of patients with cervical carcinoma［J］.J Exp Clin Cancer Res，2010，29：78.

［9］Klatka J，Grywalska E，Tabarkiewicz J，et al.Dendritic cell subsets in neoplastic tissue and peripheral blood of laryngeal cancer patients：relation with grade and stage of the disease［J］.Oncol Rep，2012，28（1）：207-17.

［10］Gritzapis A D，Dimitroulopoulos D，Paraskevas E，et al.Large-scale expansionofCD3（+）CD56（+）lymphocytes capable of lysing autologous tumor cells withcytokine-rich supernatants［J］.Cancer Immunol Immunother，2002，51（8）：440-8.

［11］Wang Q J，Wang H，Pan K，et al.Comparative study on anti-tumor immuneresponse of autologous cytokine-induced killer（CIK）cells，dendritic cells-CIK（DC-CIK），and semi-allogeneic DC-CIK［J］. Chin J Cancer，2010，29（7）：641-8.

［12］Budhu S，Wolchok J，Merghoub T.The importance of animal models in tumor immunity and immunotherapy［J］.Curr Opin Genet Dev，2014，24：46-51.

［13］Sharpe A H，Abbas A K.T-cell costimulation-biology，therapeutic potential，and challenges［J］.N Engl J Med，2006，355（10）：973-5.

［14］Leung J，Suh W K.The CD28-B7 family in anti-tumor Immunity：Emerging concepts in cancer immunotherapy［J］.Immune Netw，2014，14（6）：265-76.

［15］Wang E，Tomei S，Marincola F M.Reflections upon human cancer immune responsiveness to T cell-based therapy［J］.Cancer Immunol Immunother，2012，61（6）：761-70.

［16］李晓英，鲍杨漪，江蓓蕾，等.不同类型肿瘤患者自体CIK细胞治疗对机体免疫状态及临床症状改善的影响［J］.安徽医科大学学报，2012，47（4）：434-7.

Clinical efficacy of autologous DC-CIK cells therapy for patients with advanced solid tumors

Ran Baoshi，Wang Wei，Wang Gang，et al
（Dept of Medical Oncology，Affiliated Anhui Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

Objective To study the influence of immune system and clinical efficacy of DC-CIK cells therapy for patients with advanced solid tumors.Methods Sixty patients were divided into two groups.The treatment group was received two cycles'reinfusion of DC-CIK cells，while the control group was not.The changes of proportional of immune cells and quality of life were compared before and after the treatment，and the clinical efficacy and adverse reactions were also detected.Results In the treatment group，the overall response rate was 0.00%，and the disease control rate was 36.67%.The ratios of CD4+T lymphocytes，NK and CIK cells were higher than before，but the ratio of CD8+T lymphocytes was less.Patients'overall quality of life was improved and the adverse reactions were fever，allergies etc.In the control group，the ratios of CD4+T lymphocytes，NK and CIK cells are less than before，but the ratio of CD8+T lymphocytes was higher.Patients'overall quality of life was decline.and the ratio of B lymphocytes in both groups didn't change significantly.Conclusion DC-CIK cells therapy can improvethe patients'with advanced solid tumors immune function and general situations，which has a certain clinical effect and its adverse reactions are less，so it can be used as one option for the patients who suffer the failures of chemotherapy and radiotherapy.

dendritic cells；cytokine-induced killer cells；advanced solid tumor；lymphocyte subsets；quality of life

R 730.51

A

1000-1492（2016）07-1053-06

2016-03-23接收

国家自然科学基金（编号：81172172）

安徽医科大学附属省立医院肿瘤化疗科，合肥 230001

冉宝石，女，硕士研究生；季楚舒，女，教授，硕士生导师，主任医生，责任作者，E-mail：jichushu@csco.org.cn