不同温度培养诱导金黄色葡萄球菌对超高压失活的抗性及其建模

韩洪玲,袁先雯,高瑀珑,冯燕玲,董　月,朱　蕾,夏　凡,唐瑞丽

(南京财经大学食品科学与工程学院 江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室,江苏南京 210023)



不同温度培养诱导金黄色葡萄球菌对超高压失活的抗性及其建模

韩洪玲,袁先雯,高瑀珑*,冯燕玲,董月,朱蕾,夏凡,唐瑞丽

(南京财经大学食品科学与工程学院 江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室,江苏南京 210023)

探讨不同培养温度处理诱导金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)对超高压的抗性,并建立不同培养温度下金黄色葡萄球菌的超高压抗性模型。金黄色葡萄球菌经不同温度培养,在100～500 MPa的超高压条件下,选用线性、Weibull和Gompertz三种模型来拟合超高压抗性曲线,以决定系数(R2),均方误差(RMSE),精确因子(Af)和偏差因子(Bf)作为模型拟合度优劣的评判指标。实验结果表明,在100～500 MPa压力的作用下,线性模型的拟合效果不佳,R2最小值达到0.8870,Weibull和Gompertz模型对超高压的抗性具有较好的拟合性(R2≥0.9467),且Weibull模型的拟合效果最好,R2最大值达到0.9956,RMSE最小值为0.0312。因此,Weibull模型可以很好地拟合金黄色葡萄球菌以不同的培养温度胁迫后在超高压作用下的抗性曲线,随着培养温度的升高,金黄色葡萄球菌的超高压抗性呈增加趋势。

超高压,金黄色葡萄球菌,Weibull模型

在食品加工过程中,微生物常常遭到酸、碱、盐、饥饿和生长温度等非致死性条件的胁迫[1],菌体经历某一种不适环境的胁迫,之后再遇到同种类型的不适环境时,其存活能力明显升高,我们把这种作用称之为同源性保护作用;而菌体经某一种不适环境胁迫,随后在遇到其它别的不适环境时,其存活能力明显提高,这种作用称之为交叉保护作用。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是人类的一种主要的病原菌[2],在自然界中广泛分布,极易污染各类食品[3]。因此金黄色葡萄球菌常常要面临一系列的酸、碱、渗透压、高温、低温等不适环境的胁迫,由于不适条件胁迫,使金黄色葡萄球菌诱导出对胁迫环境的自我保护机制。Cebrian等[4]通过对金黄色葡萄球菌进行酸、热和过氧化氢的胁迫处理,发现与未经处理的菌株相比,经胁迫处理后的菌株对热处理的抗性均有所增加。即金黄色葡萄球菌经过酸、过氧化氢胁迫处理产生了对热处理的交叉保护作用。超高压杀菌技术是目前备受关注的一项现代食品低温杀菌技术[5-6]。因此研究金黄色葡萄球菌遭受各种不适环境的胁迫,诱导其对超高压产生交叉保护作用,有利于精准控制超高压杀菌的关键因素,避免盲目、随意地选用杀菌条件,合理优化食品超高压操作条件,对超高压杀菌的工业化应用具有重要的理论和实践指导意义。

同时,在传统热力杀菌中,通常采用一级动力学方程,D值和Z值作为热力学参数;随着非热力杀菌技术的广泛研究,许多研究表明,非热力杀菌所造成的微生物失活曲线并不一定完全遵循一级动力学方程与对数线性关系,而存在“肩部”(shoulder)和“拖尾”(tailing)现象[7]。近年来,Weibull模型以及Gompertz模型被广泛地应用于非热力杀菌的模型拟合[8-9]。Sagarzazu等[10]应用Weibull模型拟合空肠弯曲菌超高压失活模型。卢蓉蓉等[11]用线性和Weibull模型来研究超高压杀菌的动力学方程。Kim等[12]将Gompertz模型应用于超临界二氧化碳杀菌效果的研究中;冯晓慧等[13]应用Gompertz模型拟合不同热处理条件下李斯特菌的失活曲线。目前已有的这些相关研究均以线性、Weibull以及Gompertz模型来拟合加热、超高压等杀菌的动力学曲线,旨在比较、分析和确定适合描述和预测加热、超高压等杀菌过程的动力学模型,而未涉及菌体经不利条件胁迫后对超高压抗性的变化,即菌体耐压性的变化。对于金黄色葡萄球菌经不利培养温度胁迫后,是否可诱导其对超高压抗性的变化？即是否产生交叉保护作用目前尚不清楚,国内外鲜见相关报道。

本研究基于线性、Weibull和Gompertz模型拟合金黄色葡萄球菌在不同培养温度下诱导其对超高压抗性的变化,筛选最佳拟合模型,并获得可以描述金黄色葡萄球菌耐压性的特征参数值,以期为超高压杀菌技术食品工业中的应用奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

HHP-3型超高压设备(压力范围为0～ 800 MPa)内蒙古包头市科发新型高技术食品机械有限公司;Allegra64R型高速低温离心机美国Beckman公司;UV-9100型紫外可见分光光度计北京北分瑞利分析仪器有限责任公司;FR-900型多功薄膜封口机上海麦尔多食品机械有限公司;BSA3202S型Sartorious精密电子天平北京塞多斯天平有限公司;Millipore一次性针头过滤器(0.22 μm)北京智杰方远科技有限公司;XW-80型旋涡混合器上海医科大学仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1不同培养温度下金黄色葡萄球菌生长曲线的建立将金黄色葡萄球菌菌种转接至TSB中,置于15、25、36、45 ℃的温度下振荡培养,在15 ℃的温度培养下,每隔12 h取样一次;而25、36、45 ℃的温度培养下,每隔2 h取样一次,在600 nm波长下,用紫外可见分光光度计测定吸光度值(OD)来建立其生长曲线。根据上述建立的生长曲线,将金黄色葡萄球菌菌种转接至TSB中,置于15、25、36、45 ℃的温度下振荡培养至所对应的稳定期,以备超高压处理。

1.2.2金黄色葡萄球菌菌悬液的制备和超高压处理分别取经过上述不同培养温度下培养至稳定期的金黄色葡萄球菌菌悬液100 mL,离心(3000 r/min,10 min),弃上清液,沉淀下的菌体以PBS洗涤1次,再以PBS制成菌悬液,调整菌体浓度,使起始菌数N0约为107CFU/mL,将其分装于5 mL的医用无菌塑料瓶,热封口,不留顶隙,冷藏。按照实验设计控制高压介质温度,待样品温度与高压介质温度达到平衡后,进行超高压处理,升压速度为150 MPa·min-1,卸压速度为300 MPa·s-1,每个样品重复处理3次[16]。

1.2.3金黄色葡萄球菌存活的测定对1.2.2节所制备的金黄色葡萄球菌菌悬液经高压处理后,立即进行菌落总数的测定,以无菌生理盐水适当稀释对照及超高压处理后的供试菌悬液,于胰酪蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)平板36 ℃培养72 h后,按文献[17]进行菌落计数,检测限为1 CFU/mL。存活的表达:经高压处理后每毫升菌悬液的菌落数为Nt(CFU/mL),未经超高压处理的对照组每毫升菌悬液的菌落数为N0(CFU/mL)。

1.3模型的建立

这时，一队钢盔闪亮，皮鞋锃亮的宪兵队走了过来，宪兵们个个戴着白手套，紧握着胸前的汤姆森，领队的是几个官长。一个看来是最大的长官皱着眉头停在如玉豆腐坊前，抬眼看了看字号，指指满堂的黑布白字：“你家还在办丧事？为什么还留在城里？”

1.3.1线性模型线性模型是描述微生物失活的经典模型,采用D值或Z值(使D值减少90%所需升高的温度)来确定食品中微生物的热杀菌工艺条件,用方程(1)来表示:

式(1)

式中:S(t)表示菌体存活分数,即Nt/N0;N0为初始菌体的数量,t为热处理时间(min),Nt为t时刻的菌体数量;D值表示在一定温度下使微生物的存活数量降低一个对数单位所需的时间。

1.3.2Weibull模型基于概率分布的Weibull模型将微生物失活曲线看作是其失活分布的积累形式,能较好地拟合其失活[18],适于热力和非热力杀菌下微生物失活模型的拟合,用方程(2)来表示:

式(2)

式中,S(t)表示菌体存活百分数,即Nt/N0;N0为初始菌体数量,t为处理时间(min),Nt为t时刻的菌体数量;δ和ρ分别为规模和形态参数,其中δ表示菌体数量首次减少一个数量级所需的时间;ρ代表曲线的形状参数,当ρ=1时,所得出的曲线为直线;当ρ>1时,曲线为凸形曲线;当ρ<1时,曲线为凹形曲线[19]。

图1　在25 ℃培养金黄色葡萄球菌在不同压力下的失活曲线Fig.1　Curves of inactivation of Staphylococcus aureus incubated at temperature of 25 ℃ under different pressures

1.3.3Gompertz 模型近年来,许多研究表明Gompertz模型也能够较好地拟合微生物的失活曲线,用方程(3)来表示:

式(3)

式中,S(t)表示菌体存活分数,即Nt/N0;N0为初始菌体数量;t为处理时间,min;Nt为t时刻的菌体数量;A为菌体数量的最大减少值,A=lg(Nmin/N0);Nmin为剩余的最小菌量;B菌体最大比失活率(min-1);C为菌体失活延滞时间(min)。

1.3.4模型拟合度的比较采用JMP10.0软件(SAS公司)对实验数据分别进行线性、Weibull和Gompertz模型的拟合,得到3种金黄色葡萄球菌的超高压抗性模型。以决定系数R2、均方根误差RMSE、精确因子Af和偏差因子Bf四个参数来评判模型拟合度的优劣[20]。RMSE和Af、Bf的值分别按式(4)、式(5)和式(6)计算[21]。

式(4)

式(5)

式(6)

式(4)、式(5)和式(6)式中,n为测定值数。

1.3.5数据处理数据处理通过JMP(10.0)软件,采用Duncan新复极差法(SSR)进行多重比较,结果以平均值±标准差表示,p<0.05为差异显著。

2　结果与分析

2.1不同生长温度下金黄色葡萄球菌生长曲线

金黄色葡萄球菌在15、25、36、45 ℃的温度培养下,通过绘制不同培养温度下的生长曲线,发现其所对应生长稳定期的分别为:360、22、18、20 h。

2.2三种模型拟合曲线

以线性、Weibull和Gompertz模型拟合不同培养温度下,金黄色葡萄球菌在100、200、300、400、500 下的超高压抗性曲线,培养温度为25 ℃时,结果见图1;15、36、45 ℃三种培养温度的抗性曲线未列出。从图1曲线的走势可以直观判断出Weibull和Gompertz模型较线性模型有更好的拟合性,15、36、45 ℃三种培养温度也有同样的结果。

2.3Weibull和Gompertz模型的参数分析

Weibull模型与Gompertz模型分别有2个和3个参数,通过模型拟合得到参数的相应值见表1。Weibull模型中,规模参数δ与曲线的形状无关,反映了超高压灭菌效果及对超高压抗性的大小,即δ表示金黄色葡萄球菌对超高压作用的抗性参数,抗性大小与参数δ呈正比,δ值越大表示抗性越强;对表1中δ进行分析,发现在相同压力下,随着培养温度的增加,δ值呈明显增加趋势,以上实验结果表明,较高的生长温度可诱导金黄色葡萄球菌对超高压抗性的增加。相同培养温度下,随着压力的增加,δ值呈下降趋势,表明压力越高,超高压的杀菌效果越明显。

表1　不同压力下基于线性、Weibull和Gompertz模型拟合曲线参数Table 1　Fitting parameters of linear,Weibull and Gompertz models under different pressure

ρ作为形状参数,一方面反映了抗性曲线的形状,当ρ=1时,所得出的曲线为直线;当ρ>1时,曲线呈凸形,向下弯曲;当ρ<1 时,曲线呈凹形,向上弯曲[22]。对表1中ρ值进行分析,并结合图1拟合曲线可以发现在压力较低时(100～ 200 MPa),ρ<1,所得抗性曲线向上弯曲;在300～ 500 MPa处理条件下,ρ>1,曲线向下弯曲。ρ值的大小除了反应抗性曲线的形状,其值的大小也反映了特定的生物学意义[23],当ρ<1时,表明模型曲线随着时间的延长下降趋势减缓,金黄色葡萄球菌失活率减小;当ρ>1,表明抗性模型曲线随着时间的延长下降趋势变快,菌体失活率变快,金黄色葡萄球菌存活率随着压力的增大而迅速减小,即随着时间的延长其越容易死亡,失活率增大。

Gompertz模型中,参数A表示菌体数量的最大减少值,反映超高压的杀菌效果。由表1可知,随着压力的增大,参数A呈增加趋势,表明压力越大,金黄色葡萄球菌失活数量越大;而在相同的压力作用下,随着培养温度的提高,参数A基本表现为降低的趋势,表明随着培养温度的提高,金黄色葡萄球菌对压力的抗性在增加,即提高金黄色葡萄球菌培养温度可诱导其抗性增加。B值为超高压处理过程中菌体最大比失活率;C值表示菌体失活延滞时间,由表1可知,压力较低时(100～200 MPa),0.02≤B≤0.17;在300～500 MPa的处理条件下,金黄色葡萄球菌的比失活率增大,失活延滞时间缩短,表明高压力下,可以达到快速高效灭菌的效果。

2.4拟合模型的合适性评价

经不同的培养温度,金黄色葡萄球菌在100、200、300、400、500 MPa的作用下,超高压抗性拟合曲线的参数R2、RMSE、Af和Bf见表2。其中,决定系数R2和RMSE表示模型的精确度、可靠度,R2越接近于1,RMSE越小,模型拟合度越高;由表2可知,100 MPa和200 MPa的压力下,线性、Weibull和Gompertz模型R2均大于0.9422,Weibull模型均方根误差0.0312≤RMSE≤0.1403,Gompertz模型均方根误差0.0294≤RMSE≤0.1076,这3种模型都可以用来拟合金黄色葡萄球菌的超高压抗性曲线。

表2　不同压力下线性Weibull和Gompertz抗性模型曲线拟合效果对比Table 2　Comparing the fitting effects of linear,Weibull and Gompertz models under different pressures

注:R2表示决定系数;RMSE表示均方根误差;Af表示精确因子;Bf表示偏差因子。

随着压力的增大,Weibull和Gompertz模型则表现出较好的拟合性,如在300～500 MPa的处理条件下,线性模型的R2值最小为0.8870,而Weibull和Gompertz模型的R2值均大于0.9467,表明Weibull和Gompertz模型的拟合效果优于线性模型。

为了进一步评价Weibull和Gompertz模型拟合效果,比较这两种模型的精确因子Af和偏差因子Bf。Af反映了预测值与实测值偏离的程度,Af值越小表明模型预测值与实测值越接近,模型越精确,Af越接近于1模型的拟合度越好;Bf>1表示模型预测值比实测值高,当Bf<1表示模型预测值比实测值低,Bf越接近1,模型拟合度也越高。由表2可知,Weibull模型精确因子1.0272≤Af≤1.4153,Gompertz模型精确因子1.0522≤Af≤2.1450。均方根误差RMSE越小,模型拟合度越高;而Af值越接近于1模型的拟合度越高,说明Weibull模型较Gompertz模型拟合效果较好。偏差因子Bf在0.901.15,认为模型拟合效果不可接受[24]。由表2可知,Weibull模型0.9018≤Bf≤1.0483;Gompertz模型0.4662≤Bf≤1.0642;所以,Gompertz模型拟合效果可接受,而Weibull模型拟合效果最好。

2.5拟合模型的验证

为了进一步验证Weibull模型可以有效拟合金黄色葡萄球菌对超高压失活的抗性曲线,实验选取36 ℃下培养的金黄色葡萄球菌在150、250、350、450 MPa的条件下进行超高压灭菌,相比之下,以Weibull模型拟合金黄色葡萄球菌在超高压作用下的失活曲线,拟合程度高(R2≥0.9813),精确因子1.0105≤Af≤1.1151,偏差因子0.9120≤Bf≤1.031,均方根误差0.0388≤RMSE≤0.1171,所以Weibull模型可用来拟合金黄色葡萄球菌对超高压失活的抗性曲线。

3　结论

采用线性、Weibull和Gompertz模型拟合了不同培养温度诱导金黄色葡萄球菌的超高压抗性曲线,以决定系数R2、均方根误差RMSE、精确因子Af和偏差因子Bf这4个参数来评判模型拟合度的优劣,结果表明Weibull模型能更好地拟合不同培养温度诱导金黄色葡萄球菌的超高压抗性,Weibull和Gompertz模型的拟合参数皆表明在不同培养温度胁迫下,随着培养温度的升高,金黄色葡萄球菌的超高压抗性呈增加趋势。这为研究培养温度及其它别的胁迫处理条件诱导微生物的超高压抗性及其机理提供理论依据和新思路。

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Modelling and the induced resistance of inactivation ofStaphylococcusaureusto high hydrostatic pressure incubated at different culture temperatures

HAN Hong-ling,YUAN Xian-wen,GAO Yu-long*,FENG Yan-ling,DONG Yue,ZHU Lei,XIA Fan,TANG Rui-li

(Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing,Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety,College of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance and Economics,Nanjing 210023,China)

The resistance models ofStaphylococcusaureus(ATCC6538)were established in order to investigate the development of resistance responses to high hydrostatic pressure(HHP)treatment inS.aureuscultured at different temperatures. The resistance data forS.aureusincubated at different temperatures were obtained under the conditions of the pressures from 100 to 500 MPa. Then Linear,Weibull,and Gompertz models were selected to fit the curves of resistance to HHP ofS.aureus. Regression coefficients(R2),root mean square error(RMSE),accuracy factor(Af)and bias factor(Bf)were used to evaluate the goodness of fit for the three models. Results showed that the Linear model provided a poor fit for the data,which has minimumR2(0.8870),and Weibull model and Gompertz model showed suitable goodness-of-fit at five pressure levels between 100 to 500 MPa(R2≥ 0.9467). The Weibull model,which had maximumR2(0.9956)and minimum RMSE(0.0312),could be fitted perfectly to the curves of resistance to HHP in the three models. In conclusion,Weibull model showed ideal goodness-of-fit to the curves of resistance to HHP inactivation ofStaphylococcusaureus. Moreover,with increasing incubation temperatures,the pressure resistance ofS.aureusincreased.

high hydrostatic pressure(HHP);Staphylococcusaureus;Weibull model

2016-01-18

韩洪玲(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：食品微生物与生物技术，E-mail:942924471@qq.com。

高瑀珑(1974-)，男，博士，教授，主要从事食品微生物与生物技术方面的研究，E-mail:yulonggao19762001@163.com。

江苏省自然科学基金(BK20131435)；江苏省教育厅省属高校自然科学研究(12KJB550003)；国家自然科学基金(31371864)；粮食公益性行业科研专项(201413007-05)；江苏省高校优势学科建设工程资助项目(PADP)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)14-0102-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.012