微波协同双水相提取桔梗茎总黄酮及抗氧化活性研究

钟方丽,王文姣,2,王晓林,*,修洋洋

(1.吉林化工学院,化学与制药工程学院,吉林吉林 132022;2.吉林大学化学学院,吉林长春 130012)



微波协同双水相提取桔梗茎总黄酮及抗氧化活性研究

钟方丽1,王文姣1,2,王晓林1,*,修洋洋1

(1.吉林化工学院,化学与制药工程学院,吉林吉林 132022;2.吉林大学化学学院,吉林长春 130012)

利用微波协同双水相法研究了桔梗茎总黄酮的提取工艺及其体外抗氧化性。首先,采用单因素和正交设计法对提取工艺进行了优化;其次,利用分光光度法研究了桔梗茎总黄酮提取液对DPPH·、·OH的清除活性。结果表明,当料液比为1∶40(m/v),微波功率为500 W,醇水比为0.8∶1,提取时间为5 min,硫酸铵质量浓度为0.30 g/mL时,桔梗茎总黄酮的提取得率较高,其平均得率为0.793%;桔梗茎总黄酮提取液对DPPH·、·OH具有较强的清除能力,且其清除活性随桔梗茎总黄酮提取液质量浓度的增加而逐渐增强。

桔梗茎,双水相,总黄酮,抗氧化

桔梗为桔梗科植物桔梗的干燥根,为药食同源的传统中药材,主要含有三萜皂苷、黄酮类等活性成分,吉林省是桔梗主产区之一[1]。桔梗的药用、食用价值很高,市场需求量很大,桔梗传统上以其根入药,现代研究表明桔梗具有祛痰镇咳、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、免疫调节等众多药理活性[2-5]。桔梗茎与桔梗根相比资源丰富、廉价易得,但桔梗茎作为废物多被丢弃,现有研究表明桔梗茎中含有大量的黄酮类活性成分,其提取物具有明显的抗炎、祛痰等生理活性[6-7]。而目前关于桔梗茎总黄酮的研究开展较少,加强对桔梗茎的科学研究,可以变废为宝,减少资源的浪费,提高药农收益。黄酮类化合物具有增强人体免疫力、保肝、降血脂、抗衰老等多种生理活性[8],是一类前景广阔的天然抗氧剂。黄酮类化合物通过清除自由基来实现它的抗氧化活性,评价天然产物的抗氧化活性已成为研究保健食品、药品的重要内容之一[9-11]。双水相体系是一种具有工艺条件温和等优点的新型分离技术,已应用于天然产物中活性成分的分离[12-13]。本实验采用微波协同双水相法对桔梗茎中的黄酮类成分进行提取,并考察了其提取液清除DPPH·、·OH的活性,评价了其抗氧化能力,以期为合理利用桔梗茎提供依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

桔梗茎吉林省均林中草药种植有限公司;芦丁成都曼思特生物科技有限公司;DPPH·上海如吉生物科技有限公司;邻二氮菲天津市科密欧化学试剂有限公司;水为重蒸馏水;石油醚、亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸铵天津市永大化学试剂有限公司;磷酸二氢钠、氢氧化钠、正丙醇、无水乙醇等均为国产分析纯试剂。

TU-1810型紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;MAS-Ⅱ型常压微波辐射萃取仪上海新仪微波化学科技有限公司;FA2004N型电子天平上海精密科学仪器有限公司;KQ118型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;DHG-9076A型电热鼓风干燥器上海精密实验设备有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样品总黄酮含量测定精密称取干燥至恒重的芦丁对照品9.0 mg,置于50 mL容量瓶中,加60%乙醇溶解,定容,摇匀,配制成质量浓度为0.18 mg/mL的对照品溶液,精密吸取芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,置于25 mL容量瓶中,加5% NaNO2溶液0.4 mL,摇匀,放置6 min,加10% Al(NO3)3溶液0.4 mL,摇匀,放置6 min,加4% NaOH溶液4.0 mL,再加60%乙醇定容至刻度,摇匀,放置15 min。以相应的试剂为空白,按照分光光度法,在510 nm处测定其吸光度,以吸光度为纵坐标,质量浓度为横坐标绘制标准曲线[14]。吸取桔梗茎总黄酮提取液适量,置于25 mL容量瓶中,按上述方法进行显色,测定其吸光度,计算提取液中总黄酮的含量。

总黄酮含量(mg)={[(A-0.0023)/14.599]×25×25}/V

式中:A为提取液在510 nm的吸光度;V为含量测定吸取的提取液体积(mL)

1.2.2单因素实验天然植物中总黄酮的提取温度如果较低,总黄酮提取不充分,会导致总黄酮得率较低,随着提取温度的升高,总黄酮渗透、扩散和溶解能力增强,从而促进黄酮类化合物的溶出。而如果提取温度过高,其它非黄酮类化合物也易被提取出来,而且温度过高,可能会导致部分黄酮类化合物受热结构被破坏,氧化分解,导致总黄酮得率降低。所以根据相关文献[15-16]将文中各组实验的总黄酮提取温度设置为50 ℃。

1.2.2.1正丙醇-水比对提取效果的影响称取脱脂的桔梗茎粉1 g,料液比为1∶30,硫酸铵质量浓度为0.35 g/mL,正丙醇-水比分别设定为0.4∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1,于微波功率400 W提取5 min,过滤,滤液于分液漏斗中静置分层,上层醇相以30%乙醇水溶液定容至25 mL,吸取上相溶液适量,按1.2.1节测定提取液中吸光度值,计算总黄酮得率[17]。计算公式如下:

总黄酮得率(%)=(m1/m2)×100

式中:m1为提取液中总黄酮的质量(g);m2为桔梗茎粉末的质量(g)。

1.2.2.2硫酸铵质量浓度对提取效果的影响称取脱脂的桔梗茎粉1 g,料液比为1∶30,正丙醇-水比为0.8∶1,硫酸铵质量浓度分别为0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g/mL,于微波功率400 W提取5 min,然后按1.2.2.1节实验,计算总黄酮得率。

1.2.2.3微波时间对提取效果的影响称取脱脂的桔梗茎粉1 g,料液比为1∶30,正丙醇-水比为0.8∶1,硫酸铵质量浓度为0.30 g/mL,微波功率为400 W，微波提取时间分别为1、5、10、15、20、25 min,然后按1.2.2.1节实验,计算总黄酮得率。

1.2.2.4微波功率对提取效果的影响称取脱脂的桔梗茎粉1 g,固定正丙醇-水比为0.8∶1,硫酸铵质量浓度为0.30 g/mL,料液比为1∶30,设定微波功率分别为300、400、500、600、700、800 W,微波提取5 min,然后按1.2.2.1节实验,计算总黄酮得率。

1.2.2.5料液比对提取效果的影响称取脱脂的桔梗茎粉1 g,固定正丙醇-水比为0.8∶1,硫酸铵质量浓度为0.30 g/mL,料液比分别设定为1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45,微波功率为400 W,微波提取5 min,然后按1.2.2.1节实验,计算总黄酮得率。

1.2.3正交实验通过单因素实验结果可知,正丙醇-水比由0.4∶1提高到0.8∶1时,桔梗茎总黄酮得率由0.265%增加到0.556%,继续提高正丙醇-水比,总黄酮得率变化很小,所以在后续实验中将正丙醇-水比固定为0.8,在正交实验中选取硫酸铵质量浓度、提取时间、微波功率、料液比4个因素进行L9(34)正交设计,进一步考察各因素对桔梗茎总黄酮得率的影响,设定正交实验因素水平,见表1。

表1　正交实验因素水平表

1.2.4工艺验证性实验为了考察上述优选的微波协同双水相提取桔梗茎总黄酮工艺的稳定性,称取脱脂的桔梗茎粉1 g,按优化的提取工艺条件进行实验,即正丙醇-水比为0.8∶1、微波提取时间5 min、料液比1∶40,硫酸铵质量浓度为0.30 g/mL,微波功率为500 W,重复实验3次,计算总黄酮得率。同时吸取上层醇溶液45 mL制成干浸膏,测定干浸膏中总黄酮含量。

1.2.5对比实验称取脱脂的桔梗茎粉1 g,以正丙醇-水比0.8∶1加入正丙醇水溶液40 mL,设定微波功率为500 W,微波提取5 min,过滤,计算总黄酮得率。同时吸取滤液45 mL制成干浸膏,测定干浸膏中总黄酮的含量。

总黄酮含量(%)=(m1/m2)×100

式中:m1为提取液中总黄酮的质量(mg);m2为桔梗茎提取液干浸膏的质量(mg)。

1.2.6体外抗氧化性实验

1.2.6.1清除DPPH·实验DPPH·的乙醇溶液中加入自由基清除剂时,其在517 nm波长处的吸光度变小,该方法可用于评价天然产物对自由基清除能力,用清除率表示,清除率越大,表明该物质清除DPPH·的能力越强。

将桔梗茎总黄酮提取液分别配制成质量浓度为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/mL的供试品溶液。分别吸取不同质量浓度的桔梗茎供试品溶液2.0 mL于10 mL比色管中,加入新鲜配制的0.2 mmoL/L DPPH·溶液2.0 mL,混匀,于室温暗处避光反应30 min,以50%乙醇溶液作对照,在517 nm处测定吸光度A样品。其他条件不变,用2.0 mL蒸馏水代替测定A样品中的桔梗茎供试品溶液,其他操作同上,在517 nm处测定吸光度A空白。分别吸取不同质量浓度的桔梗茎供试品溶液2.0 mL于10 mL比色管中,加入2.0 mL无水乙醇,混匀,其他操作同上,在517 nm处测定吸光度A对照。

将VC配成质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的对照溶液,同上操作。按照下式计算桔梗茎总黄酮提取液、VC溶液对DPPH·的清除率[18]。

DPPH·清除率(%)=(A空白-A样品+A对照)/A空白×100

1.2.6.2清除·OH实验邻二氮菲与硫酸亚铁反应生成红色配合物,·OH与该配合物反应使邻二氮菲-Fe2+氧化为邻二氮菲-Fe3+,当向其中加入抗氧化剂时,抗氧化剂与·OH作用,从而降低了·OH对Fe2+的氧化,而使吸光度值发生变化,所以常采用该方法来评价天然产物的抗氧化能力。

将桔梗茎总黄酮提取液分别配制成质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的供试品溶液。分别吸取不同质量浓度的桔梗茎供试品溶液1.0 mL于10 mL比色管中,加入浓度为1.5 mmoL/L的邻二氮菲无水乙醇溶液1.0 mL,依次加入磷酸盐缓冲液(pH为7.4～7.5)2.0 mL、0.75 mmoL/L硫酸亚铁溶液1.0 mL,充分混匀,加入1.0 mL 0.1%的H2O2,37 ℃下恒温反应60 min,于536 nm处测其吸光度(As)。其他条件不变,用蒸馏水代替测定As中的供试品溶液,于536 nm处测其吸光度(Ap)。其他条件不变,用蒸馏水替代测定AP实验中的0.1%的H2O2,于536 nm处测其吸光度(Ab)。

将VC配成质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的对照溶液,同上操作。按照下式计算桔梗茎总黄酮提取液、VC溶液对羟基自由基的清除率[19]。

羟基自由基·OH清除率(%)=[(AS-AP)/(Ab-AP)]×100

1.2.7数据处理文中每组实验均重复3次,结果以平均值±标准偏差表示。采用Excel和Origin6.0软件对实验数据进行整理及统计分析。

2　结果与分析

2.1总黄酮含量测定

以芦丁对照品溶液的吸光度为纵坐标,质量浓度(mg/mL)为横坐标,绘制标准曲线,回归方程:A=11.599C+0.0023,r=0.9999。式中:A为所测溶液的吸光度值;C 为溶液中芦丁的质量浓度(mg/mL)。结果表明芦丁在0.0072～0.0432 mg/mL范围内呈良好线性关系。

2.2单因素实验

2.2.1正丙醇-醇水比对提取效果的影响由图1可知,当正丙醇-水比在0.4∶1～0.9∶1范围内,总黄酮得率先随着醇水比的增大而逐渐提高,当醇水比为0.8∶1时得率达到较高值,继续增加醇水比,得率变化较小。分析其原因可能是因为当醇水比较小时,水用量较多,提取溶剂的极性较高,而桔梗茎总黄酮可能属于中等级性的成分,随着醇水比逐渐增加,正丙醇用量逐渐增多,提取溶剂的极性逐渐降低,所以桔梗茎总黄酮的提取得率随着醇水比的增加而逐渐增加,当醇水比为0.8∶1时得率达到较高值,继续增加醇水比,提取溶剂的极性进一步降低,总黄酮得率变化较小。结果见图1。

图1　醇水比对提取效果的影响Fig.1　The influence of ratio between ethanol and water on extraction efficiency

2.2.2硫酸铵质量浓度对提取效果的影响由图2可知,硫酸铵质量浓度由0.20 g/mL增加到0.30 g/mL时,总黄酮得率由0.582%逐渐提高到0.635%,然后开始逐步下降,分析原因可能是因为桔梗茎总黄酮具有一定的醇溶性,随着硫酸铵质量浓度的增加,上相中正丙醇的相对体积分数逐渐增加,而下相正丙醇的相对体积分数则逐渐降低,当硫酸铵质量浓度达到0.30 g/mL时,总黄酮得率达到了最高值,继续提高硫酸铵质量浓度,可能是因为在水相中产生了盐析效应从而使总黄酮得率开始下降。

图2　硫酸铵质量浓度对提取效果的影响Fig.2　The influence of mass concentration of ammonium sulfate on extraction efficiency

2.2.3微波提取时间对提取效果的影响由图3可知,随微波提取时间由1 min延长到5 min时,总黄酮得率就达到了最高值0.613%,继续延长提取时间,总黄酮得率由0.613%开始逐渐下降到0.567%。分析原因可能是桔梗茎中黄酮类成分的溶出需要一定时间,时间太短,溶出不完全,从而导致总黄酮得率较低,而如果提取时间过长,桔梗茎中黄酮类成分不再溶出,而且溶剂有一定损失,时间过长会使桔梗茎中的某些黄酮类化合物结构被破坏,所以导致总黄酮得率下降。

图3　提取时间对提取结果的影响Fig.3　The influence of extraction time on extraction efficiency

2.2.4微波功率对提取效果的影响由图4可知,当微波功率由300 W提高到400 W时,桔梗茎总黄酮得率就达到了最高值0.635%,当微波功率由400 W继续提高到800 W时,总黄酮得率开始随着微波功率的增加而逐渐下降。分析原因可能是微波功率越大,体系吸收的微波能量就越高,桔梗茎中黄酮类成分的溶出就越多,而当微波功率超过400 W以后,短时间内会使桔梗茎中的部分黄酮类化合物结构被破坏,从而导致总黄酮得率下降。

图4　微波功率对提取效果的影响Fig.4　The influence of microwave power on extraction efficiency

2.2.5料液比对提取效果的影响由图5可知,当料液比由1∶25逐渐增加到1∶40时,桔梗茎总黄酮得率由0.542%提高到最高值0.72%,将料液比继续增加到1∶45,总黄酮得率略有下降。分析原因可能是料液比太小,提取溶剂渗透并扩散到桔梗茎细胞内的速度以及黄酮类成分向溶剂中扩散的速度较小,桔梗茎中的黄酮类成分提取不充分,从而导致得率低;当料液比增加到一定比例后,总黄酮得率达到了最高值,如果继续增加料液比,除黄酮类成分外,其他类物质溶出也较多,可能是溶出的其他类成分干扰了总黄酮的含量测定,从而表现出总黄酮得率略有下降。结果见图5。

图5　料液比对提取效果的影响Fig.5　The influence of ratio between material and solvent on extraction efficiency

2.3正交实验

正交实验结果见表2。通过正交实验结果可知4种因素对桔梗茎总黄酮得率的影响大小依次为:B>C>A>D,即微波提取时间>微波功率>硫酸铵质量浓度>料液比。桔梗茎总黄酮的最佳提取工艺条件为A2B2C3D2,即正丙醇-水比固定为0.8∶1、微波提取时间5 min、料液比1∶40,硫酸铵质量浓度为0.30 g/mL,微波功率为500 W。

表2　正交实验结果

2.4工艺验证性实验

3次工艺验证实验桔梗茎总黄酮的得率分别为0.798%、0.793%、0.789%,平均为0.793%,RSD为0.57%。干浸膏中的总黄酮的含量分别为13.54%、13.47%、13.44%,平均为13.48%,实验结果表明,经过单因素及正交实验优选的桔梗茎总黄酮提取工艺条件稳定,适合规模化生产。

2.5对比实验

在不加入分相盐硫酸铵的条件下,按照上述提取工艺进行微波提取3次,同法制成干浸膏。总黄酮的得率分别为0.818%、0.809%、0.813%,平均为0.813%。经含量测定可知干浸膏中的总黄酮的含量分别为10.43%、10.41%、10.47%,平均为10.44%。由实验结果可知,微波协同双水相提取法的总黄酮得率略低于微波提取法,但由于分相盐硫酸铵的加入,使微波协同双水相提取法制备的干浸膏中总黄酮含量明显高于微波提取法,结果表明双水相对桔梗茎中的黄酮类成分起到了一定的富集作用。

2.6体外抗氧化性实验

2.6.1清除DPPH·实验由图6可知,黄酮提取液和VC溶液对DPPH·的清除率均随着其质量浓度的增加而逐渐增大,当桔梗茎总黄酮提取液和VC溶液质量浓度为0.6 mg/mL时,其对DPPH·的清除率分别为88.69%、90.82%。实验结果表明,桔梗茎总黄酮提取液对DPPH·具有明显的清除能力,其清除能力与VC溶液相差无几,结果见图6。

图6　VC对照液、桔梗液对DPPH·的清除率Fig.6　The scavenging ratio of VC control solution and Platycodon grandiflorum solution to DPPH·

2.6.2清除·OH实验由图7可知,桔梗茎总黄酮提取液和VC溶液对·OH的清除率均随着其质量浓度的增加而逐渐增大,当桔梗茎总黄酮提取液和VC溶液质量浓度为0.6 mg/mL时,其对·OH的清除率分别为69.72%、85.28%。实验结果表明,桔梗茎总黄酮提取液对·OH具有一定的清除能力,其清除能力低于VC溶液。

图7　VC对照液、桔梗茎提取液对·OH的清除率Fig.7　The scavenging ratio of VC control solution and Platycodon grandiflorum solution to ·OH

3　结论

本实验采用单因素和正交实验法对微波协同双水相提取桔梗茎总黄酮的工艺进行了优化。其最佳工艺条件为:取脱脂后的桔梗茎粉末适量,以正丙醇水溶液为提取溶剂,正丙醇-水比固定为0.8∶1,料液比1∶40,硫酸铵质量浓度为0.30 g/mL,在50 ℃于微波功率500 W下提取5 min,过滤,滤液于分液漏斗中静置分层,上层醇相以30%乙醇水溶液定容至25 mL,吸取上相溶液适量,按1.2.1节测定提取液中吸光度值,计算总黄酮得率。在此工艺条件下,桔梗茎总黄酮得率为0.793%,提取干浸膏中的总黄酮的含量为13.48%,结果表明微波协同双水相提取法制备的干浸膏中总黄酮含量明显高于微波提取法。本实验同时采用分光光度法研究了桔梗茎总黄酮提取液的抗氧化活性,结果表明:桔梗茎总黄酮提取液对DPPH·具有明显的清除能力,其清除能力与VC溶液相当;桔梗茎总黄酮提取液对·OH具有一定的清除能力,但其清除能力略低于VC溶液。

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Study on extraction technology of total flavonoids inPlatycodongrandiflorumstems with aqueous two-phase cooperated with microwave methods and its antioxidant ability

ZHONG Fang-li1,WANG Wen-jiao1,2,WANG Xiao-lin1,*,XIU Yang-yang1

(1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering,Jilin Institute of Chemical Technology,Jilin 132022,China;2.School of Chemistry,Jilin University,Changchun 130012,China)

Aqueous two-phase cooperated with microwave methods were applied to explore the extraction technology of total flavonoids inPlatycodongrandiflorumstems and its antioxidant abilityinvitrowas studied. First,the extraction technology was optimized by single factor and orthogonal test,while the scavenging activity of total flavonoids extraction solution to DPPH· and ·OH were measured by spectrophotometric method. When the ratio between material and solvent,the microwave power,the ratio between ethanol and water,the extraction time and the mass concentration of ammonium sulfate were 1∶40(m/v),500 W,0.8∶1,5 min and 0.30 g/mL respectively,the much higher average extraction yield of total flavonoids could reach about 0.793%. The activity test had shown that total flavonoids solution extracted fromPlatycodongrandiflorumstems had strong scavenging activity to DPPH· and ·OH,and the scavenging activity might gradually be enhanced with the increase of mass concentration of total flavonoids in extraction solution.

Platycodongrandiflorumstems;aqueous two-phase;total flavonoids;antioxidant

2015-11-11

钟方丽(1970-)，女，博士，教授，主要从事天然产物化学成分的分离与生物活性等方面的工作，E-mail：fanglizhong@sina.com。

王晓林(1969-)，男，硕士，副教授，主要从事天然产物有效成分的提取及纯化工艺等方面的工作，E-mail：wangxiaolin69@eyou.com。

TS255.1

B

1002-0306(2016)12-0267-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.042