莲藕多糖的提取工艺优化及理化特性研究

孙　杰,易　阳,2,王宏勋,2,王丽梅,闵　婷,2,周　敏,2,*

(1.武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北武汉 430023;2.湖北省生鲜食品工程技术研究中心,湖北武汉 430023;3.武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉 430023)



莲藕多糖的提取工艺优化及理化特性研究

孙杰1,易阳1,2,王宏勋1,2,王丽梅2,3,闵婷1,2,周敏1,2,*

(1.武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北武汉 430023;2.湖北省生鲜食品工程技术研究中心,湖北武汉 430023;3.武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉 430023)

采用响应面法优化莲藕多糖的提取工艺,并初步探析多糖的理化特性。在单因素实验基础上,选取提取温度、提取时间和均质转速为影响因素,以莲藕多糖提取得率为响应值建立三因素三水平回归模型。基于回归模型分析和验证实验确定莲藕多糖提取的最佳工艺条件为:提取温度89 ℃、提取时间121 min、均质转速11800 r/min,该条件下的多糖得率预测值为5.64%,实际值为5.88%。莲藕粗多糖经Sevage法脱蛋白后,DPPH自由基清除能力明显增强,其分子量小于24.2 ku且主要由吡喃型单糖组成。

莲藕多糖,提取工艺,优化,理化特性

目前,关于莲藕多糖提取工艺的优化研究主要集中于传统的热水浸提法[7-8]。超微粉碎能有效增加植物多糖的提取率[9-10],而高速均质则是一种高效的湿法粉碎方式。高速均质法能通过强的机械和液力剪切作用将大颗粒物料直接破碎,广泛应用于植物活性成分的提取制备[11-13],但在植物多糖提取中的应用相对鲜见。本研究以莲藕湿渣为原料,结合单因素实验和响应面实验优化莲藕多糖的均质提取工艺条件,初步纯化制备莲藕多糖,并考察其理化特性。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

莲藕武汉市常青花园武商量贩超市;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)Sigma公司;总蛋白测定试剂盒南京建成生物工程研究所;水溶性聚氧化乙烯标准品(重均分子量分别为24.2、41.3、67.5、149和313 ku)美国Waters公司;浓硫酸、苯酚、葡萄糖、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸、丙三醇、乙醇等均为国药分析纯。

高效液相色谱仪(差示折光检测器2414、紫外检测器2489、二元泵1525、分子排阻色谱柱Ultrahydrogel 1000)Waters公司;RE-2000A旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;12N冷冻干燥仪、XHF-D高速分散器宁波新芝生物科技股份有限公司;HH-S2数显恒温水浴锅金坛市医疗仪器厂;TD6M医用离心机长沙平凡仪器仪表有限公司;V-1100D型可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司;电子分析天平奥豪斯国际贸易(上海)有限公司;HR2168粉碎机飞利浦公司。

1.2实验方法

钾是农作物三大营养元素肥料之一，对保障农业生产、粮食安全具有举足轻重的作用。我国是一个缺钾国家，资源储量仅占世界约2%。我国探明的资源储量以盐湖钾矿为主，分布在青海柴达木盆地和新疆罗布泊地区。随着两大钾肥基地建成，特别近十年来，我国先后突破了低品位固体钾盐、尾矿利用、深部卤水开采等技术，使得钾盐可采量成倍增加。

1.2.1莲藕多糖的提取制备新鲜莲藕经洗净去节后切块粉碎,取湿藕渣(8.0±0.1)g加入适量的蒸馏水,采用高速匀浆机均质处理5 min后置于热水浴中浸提。浸提结束后离心(4500 r/min,10 min)分离上清液。上清液定容至250 mL后待测,或合并真空浓缩(55 ℃)用于制备多糖样品。将多糖浓缩液等体积分成两份,其中一份加入4倍体积的无水乙醇,置于4 ℃沉淀12 h后离心(4500 r/min,10 min)分离沉淀。挥发除去残留乙醇后,加少量水将沉淀分散溶解,采用冷冻干燥制备得到莲藕粗多糖。另一份浓缩液通过Sevage法去除蛋白质,经醇沉、冷冻干燥后制得脱蛋白多糖。莲藕多糖得率计算如下:

Y(%)=[(A×B)/C]×100

式中:Y为多糖得率(%);A为由回归方程求得的多糖浓度(mg/mL);B为多糖液体积(mL);C为莲藕质量(g)。

1.2.2莲藕多糖的分析方法

1.2.2.1基本成分测定总糖采用苯酚-硫酸法[14]测定,还原糖采用DNS法[15]测定,而多糖含量计为总糖与还原糖的含量之差。蛋白质含量采用总蛋白测定试剂盒(考马斯亮蓝法)参考其说明书测定。

1.2.2.2分子量分布分析采用0.1 mol/L硝酸钠配制2.5 mg/mL的多糖样液和聚氧化乙烯标准品溶液,经0.45 μm滤膜过滤后进样,采用差示折光检测器(检测多糖色谱图)和紫外检测器(280 nm检测蛋白质色谱图)分析。进样体积为15 μL,流动相为0.1 mol/L硝酸钠,洗脱流速为0.4 mL/min,柱温为35 ℃。测定已知分子量的聚氧化乙烯标准品的保留时间(t,min),建立lgMw-t曲线方程为lgMw=0.003t3-0.173t2+2.872t-9.325。依据标准曲线方程计算多糖样品出峰时间对应的分子量大小。

1.2.2.3红外光谱分析取1 mg样品与100～200 mg KBr粉末在研钵中混匀研磨,置于模具内压成透明薄片,在4000～400 cm-1波数范围内进行红外扫描。

1.2.2.4DPPH自由基清除率测定用蒸馏水配制系列浓度的多糖样液,取50 μL样液加入0.7 mL的100 μmol/L DPPH溶液中作为实验组,混匀后在室温下避光反应30 min,并于517 nm处测定反应液的吸光值,以水代替样液作为空白对照,以甲醇代替DPPH溶液作为样品对照[16]。DPPH自由基清除率(%)=[1-(A实验组-A样品对照)/A空白对照]×100。

1.2.3单因素实验设计

1.2.3.1料液比对多糖提取得率的影响在均质转速12000 r/min、浸提温度70 ℃和浸提时间2 h的条件下,选取料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)进行莲藕多糖的提取实验。

1.2.3.2提取温度对多糖提取得率的影响在料液比1∶15(g/mL)、均质转速12000 r/min和浸提时间2 h的条件下,选取提取温度50、60、70、80、90 ℃进行莲藕多糖的提取实验。

1.2.3.3提取时间对多糖提取得率的影响在料液比1∶15(g/mL)、均质转速12000 r/min和浸提温度70 ℃的条件下,选取提取时间1、1.5、2、2.5和3 h进行莲藕多糖的提取实验。

1.2.3.4均质转速对多糖提取得率的影响在料液比1∶15(g/mL)、浸提温度70 ℃和浸提时间2 h的条件下,选取均质转速6000、9000、12000、15000、18000 r/min进行莲藕多糖的提取实验。

1.2.4响应面实验在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken实验设计,选定提取温度(X1)、提取时间(X2)、均质转速(X3)三个因素进行响应面实验设计,因素与水平编码见表1。

表1　实验因素与水平

1.3数据处理

响应面分析采用SAS软件进行处理。组间差异比较采用SPSS软件的S-N-K检验完成,显著性水平为p<0.05。

2　结果与分析

2.1单因素实验结果

2.1.1料液比对莲藕多糖提取得率的影响由图1可知,料液比在1∶5～1∶15(g/mL)的范围内,莲藕多糖提取得率随着料液比的减小而显著增加(p<0.05),较大溶剂量有利于多糖的传质扩散[17-18]。但料液比的进一步减小并不能显著增加多糖得率(p>0.05)。综合考虑莲藕多糖的提取得率及后期浓缩制备的工作量,最佳料液比为1∶15(g/mL)。

图1　料液比对莲藕多糖提取得率的影响Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of lotus root polysaccharides

2.1.2温度对莲藕多糖提取得率的影响由图2可知,在提取温度50～90 ℃的范围内,莲藕多糖提取得率随着温度的升高而显著增加(p<0.05)。可能是伴随温度的升高,原料溶胀度增大,传质强化,从而使得多糖的溶出率增加[19]。莲藕多糖的最佳提取温度为90 ℃。

图2　温度对莲藕多糖提取得率的影响Fig.2　Effect of temperature on the extraction rate of yield of lotus root polysaccharides

2.1.3时间对莲藕多糖提取得率的影响由图3可知,在提取时间1～2 h范围内,莲藕多糖提取得率随着时间的延长而显著增加(p<0.05)。当提取时间超过2 h后,多糖的得率增加不显著(p>0.05),可能是多糖的溶出过程已达到平衡[20]。综合考虑多糖的提取得率及工艺的能耗,莲藕多糖的最佳提取时间为2 h。

图3　时间对莲藕多糖提取得率的影响Fig.3　Effect of time on the extractionyield of lotus root polysaccharides

2.1.4均质转速对莲藕多糖提取得率的影响由图4可知,在均质转速6000～12000 r/min范围内,莲藕多糖的提取得率随着均质转速的增大而显著增加(p<0.05),但当均质转速超过12000 r/min后,多糖的得率增加不显著(p>0.05)。均质转速越大,物料所受剪切作用越强,粉碎粒度越小且与溶剂接触面积越大,多糖的溶出效果越好[21]。但均质转速超过12000 r/min后,物料粉碎粒度并不能进一步降低,且过细的颗粒可能产生对多糖的吸附。莲藕多糖提取的最佳均质转速为12000 r/min。

图4　均质转速对莲藕多糖提取得率的影响Fig.4　Effect of homogenization speed on the extraction yield of lotus root polysaccharides

2.2响应面实验

响应面实验安排及结果如表3所示。以提取温度X1、提取时间X2和均质转速X3为实验因素,建立以多糖得率Y为考察指标的回归模型为:

Y=5.56+0.16X1+0.14X2-0.05X3-0.08X12-0.14X1X2+0.03X1X3-0.36X22-0.10X2X3-0.16X32

表3　响应面实验设计及结果

从表4可知,回归模型达显著水平(p<0.05),其决定系数R2为0.8532,说明响应值的变化有85.32%来源于所选因子变化,拟合程度良好,失拟项不显著(p>0.05)。从方差分析表中F值可以确定,各因素对莲藕多糖提取得率的影响顺序为:提取温度>提取时间>均质转速,二次项中仅X22对多糖得率有极显著的影响(p<0.05)。

表4　回归模型的方差分析

分析回归模型响应值Y的极值点为:X1=0.9107、X2=0.0273、X3=-0.0818,即最佳工艺参数为:提取温度89.11 ℃、提取时间120.82 min、均质转速11754.71 r/min,此时莲藕多糖得率的模型预测值为5.64%。考虑实际可操作性,确定莲藕多糖提取的优化工艺参数为:提取温度89 ℃、提取时间121 min、均质转速11800 r/min,多糖得率的模型预测值为5.64%。在优化的工艺条件下进行验证实验,莲藕多糖得率为5.88%,与模型预测值的误差在5%以内,说明采用响应面法优化所得工艺参数较为准确可靠。本研究所建立的提取方法通过均质尽可能减小物料粒度,增大与溶剂的接触面积,增大多糖的溶出效率,与传统水提法相比能够大大缩短提取时间。

2.3莲藕多糖组成及结构特征

莲藕粗多糖中多糖和蛋白质含量分别为47.94%±1.29%和2.60%±0.07%,其多糖含量较低。经过脱蛋白处理后得到脱蛋白多糖,其多糖和蛋白质含量分别为58.89%±1.09%和1.13%±0.13%。样品中多糖含量偏低,可能与较差的复溶性有关。相较之下,脱蛋白多糖样品中可溶性多糖含量显著增加(p<0.05),且蛋白质含量显著降低(p<0.05)。对比莲藕粗多糖和脱蛋白多糖的体积排阻色谱图(图5)可知:脱蛋白多糖主要为低分子量组分(<24.2 ku);粗多糖的分子量分布较宽,其大分子量组分的重均分子量约为233 ku;两种多糖中蛋白质的分子量分布无明显差异。

图5　莲藕粗多糖和脱蛋白多糖的体积排阻色谱图Fig.5　Size exclusion chromatograms of crude polysaccharides and the polysaccharides which removed protein of lotus root

由图6可知,粗多糖在指纹区干扰谱带较多且吸收强度较弱,而脱蛋白多糖谱图中干扰谱带少同时吸收强度大,说明脱蛋白后多糖的红外特性明显加强。粗多糖在3453 cm-1附近有强且宽的-OH吸收峰,系多糖骨架上的-OH形成的分子间、内氢键;在1628 cm-1处的吸收峰是多糖水合振动峰;在1080 cm-1处的峰是吡喃糖环的特征吸收峰。脱蛋白多糖在3400～3600 cm-1范围内同样有宽而强的吸收峰;1733 cm-1处的吸收峰为糖醛酸的吸收峰;1630 cm-1处的吸收峰为多糖水合振动峰;1086 cm-1处的峰为吡喃糖环的特征吸收峰[22]。

图6　莲藕粗多糖和脱蛋白多糖的红外光谱图Fig.6　IR spectra of crude polysaccharides and the polysaccharides which removed protein of lotus root

2.4莲藕多糖的DPPH自由基清除能力

由图7可知,莲藕多糖能有效清除DPPH自由基,且清除率随多糖浓度(50～800 μg/mL)的增大均显著增加(p<0.05)。在相同浓度下,脱蛋白多糖的DPPH自由基清除率均显著高于粗多糖(p<0.05)。植物多糖的自由基清除能力大多与其分子量和糖醛酸含量呈正相关[23-25],而莲藕多糖的DPPH自由基清除能力可能主要取决于低分子量组分中的糖醛酸含量。

图7　莲藕粗多糖和脱蛋白多糖的DPPH自由基清除能力Fig.7　DPPH radical scavenging activities of crude polysaccharides and refined polysaccharides of lotus root

3　结论

通过单因素实验和响应面实验优化得到莲藕多糖的最佳提取工艺参数为:提取温度89 ℃、提取时间121 min、均质转速11800 r/min,在此条件下的多糖提取得率为5.88%,与回归模型的理论预测值相近。本研究所建立的提取方法通过均质能最大程度减小物料粒度,增大物料与溶剂的接触面积,增大多糖的溶出效率,与传统水提法相比能够大大缩短提取时间,提高提取效率。莲藕粗多糖经Sevage法脱蛋白后,DPPH自由基清除能力明显增强,其分子量小于24.2 ku且主要由吡喃型单糖组成。

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Optimization of extraction and physicochemical property of polysaccharides from lotus root

SUN Jie1,YI Yang1,2,WANG Hong-xun1,2,WANG Li-mei2,3,MIN Ting1,2,ZHOU Min1,2,*

(1.College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China;2.Hubei Engineering Research Center for Fresh Food,Wuhan 430023,China;3.College of Biological & Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

Response surface methodology(RSM)was applied to optimize the extraction conditions of water-soluble polysaccharides from lotus root. The physicochemical properties of polysaccharides were then analyzed. Three independent variables,extraction temperature,extraction time and shearing speed,were chosen to establish the quadric regression equation for predicting the yield of polysaccharides. The optimum extraction conditions were obtained as follows:extraction temperature 89 ℃,extraction time 121 min and shear speed rate 11800 r/min,which led to estimated and observed values of maximal yield of polysaccharides of 5.64% and 5.88%,respectively. Crude polysaccharides extracted from lotus root were purified by Sevage method. The purified polysaccharides showed a stronger DPPH radical scavenging activity compared with the crude ones. Their molecular weights were less than 24.2 ku and mainly composed of pyranoid monosaccharides.

lotus root polysaccharides;extraction process;optimization;physicochemical property

2015-09-29

孙杰(1986-)，男，在读硕士，研究方向：植物活性成分分析评价，E-mail：sunjsz0710@163.com。

周敏(1976-)，女，博士，副教授，研究方向：农产品加工与安全，E-mail：mzhou268@163.com。

湖北省科技支撑计划项目(2015BBA203)；武汉轻工大学校立科研项目(2013D16)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)12-0256-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.040