小麦SRAP-PCR反应程序的优化及引物筛选

张彦波，肖　磊，张文娟，张清华，董　策，张希太（.邯郸市农业科学院，河北邯郸05600；.邯郸市农业局，河北邯郸05600）

小麦SRAP-PCR反应程序的优化及引物筛选

张彦波1，肖磊1，张文娟2，张清华1，董策1，张希太1
（1.邯郸市农业科学院，河北邯郸056001；2.邯郸市农业局，河北邯郸056002）

为建立最佳的小麦SRAP-PCR反应体系，进一步对小麦品种进行遗传多样性分析，采用L9（34）正交试验设计，对小麦SRAP-PCR程序中的变性时间、复性时间、延伸时间以及后35个循环的复性温度进行了优化试验。结果表明：当小麦SRAP-PCR扩增程序以变性30 s、复性60 s、延伸60 s，后35个循环复性温度55益时，扩增效果最好。应用该体系从65对SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的23对引物组合，验证了该体系具有稳定性和可靠性，可进一步用于小麦的分子标记、辅助育种与遗传分析研究。

小麦；SRAP-PCR反应程序；条件优化；引物筛选

序列相关扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是继RAPD和SSR以后出现的新型分子标记技术，由美国加州大学蔬菜系的Li和Quiros博士于2001年提出[1]。通过设计独特的双引物，对基因的ORFs（Open reading frames）特定区域进行扩增，其中，上游引物长17 bp，对外显子区域进行特异扩增；下游引物长18 bp，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。因不同个体以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。该标记具有简便、高效、产率高、高共显性、重复性好、易测序、便于克隆目标片段的特点，目前已成功地应用于作物遗传多样性分析、遗传图谱构建、重要性状标记以及相关基因克隆等方面[2，3]。

SRAP-PCR反应程序采用复性变温法扩增，最初Li等[1]设计的程序为94益预变性5 min；94益变性60 s，35益复性60 s，72益延伸60 s，5个循环；94益变性60 s，50益复性60 s，72益延伸60 s，30耀35个循环；72益延伸5 min，4益保存。随着在不同物种上的应用，该程序相应地有了不同的调整。SRAP分子标记技术在小麦研究中已有初步应用[4耀6]，但针对小麦中SRAP-PCR反应程序的优化尚未见报道，小麦最佳的扩增程序有待确定。作者对小麦SRAP-PCR反应程序进行优化，并筛选出适合于小麦的引物组合，旨为进一步小麦分子标记、辅助育种与遗传分析研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1试验材料

小麦（Triticum aestivum L.）品种为衡5229，由河北省农林科学院旱作农业研究所提供。SRAP引物18条（正向引物5条，反向引物13条）[8耀10]（表1），由上海生工生物公司合成。使用英国TECHNE公司生产的TC-5000 PCR仪进行SRAP-PCR反应。

表1　SRAP引物序列Table1　Primer sequence used for SRAP analysis

1.2试验方法

1.2.1DNA提取与引物组合取小麦叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，电泳检测其质量与纯度，浓度稀释至10 mg/L。

1.2.2PCR反应体系设计20滋L的反应体系：10伊Buffer 2滋L，Mg2+2 mmol/L，Taq聚合酶2 U，dNTPs 0.2 mmol/L，模板DNA约40 ng，引物0.6滋mol/L，无菌超纯水补足20 mL[7]。

1.2.3PCR扩增程序正交试验设计及产物的检测基于统计学原理，采用L9（34）正交试验设计，其中4个因素分别为变性时间、复性时间、延伸时间和复性温度（前5个循环复性温度35益不变），每因素均设3个水平（表2）。PCR反应程序：94益预变性5 min；94益变性、35益复性和72益延伸，各阶段时间按照试验设计进行，共5个循环；94益变性、复性和72益延伸，各阶段时间和复性温度按照试验设计进行，共35个循环；72益延伸5 min，4益保存。采用引物组合Me1/Em2、Me1/Em7和Me2/Em2，以上述PCR反应程序设定进行PCR扩增，每对引物均设3次重复。PCR扩增产物采用6豫的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，每泳道上样量为8滋L，在200V恒电压下电泳2.5h，剥胶，银染，照相，进行扩增条带的分析。

表2　SRAP-PCR的L9（34）正交试验设计Table2　Orthogonal design for SRAP-PCR［L9（34）］

1.2.4引物筛选及优化体系的验证将正向引物与反向引物随机组合的65对引物，按照优化后的扩增程序进行PCR检测，筛选出扩增条带清晰且多态性丰富的引物；并将这些引物再次按照优化后的扩增程序进行PCR，以验证优化体系的稳定性。

图1　SRAP-PCR扩增程序正交试验设计电泳结果Fig.1 The electrophoresis results of SRAP-PCR program by orthogonal design

2　结果与分析

2.1SRAP-PCR扩增程序正交试验设计的电泳结果分析

对扩增结果进行直观分析，依据扩增条带的数量、亮度和清晰度评分，9个试验结果最高为9分、最低为1分。3对引物组合Me1/Em2、Me1/Em7和Me2/Em2在扩增条带数量、扩增片段大小以及清晰度上有显著区别（图1），其中，Me1/Em2引物组合1耀9泳道扩增条带评分依次为1、8、9、1、1、1、1、1、1；引物组合Me1/Em7和Me2/Em2在扩增结果上有很大的相似性，1、2、3泳道上均有条带出现，且1耀9泳道评分相同，依次为7、8、9、1、1、1、1、1、1，其中均以3泳道评分最高。表明引物组合Me1/Em2在复性时间和延伸时间较长的情况下才能扩增出条带，并且复性时间和延伸时间同时达到最长60 s时，扩增结果最好；引物组合Me1/Em7和Me2/Em2进行条带扩增的3个复性温度对结果没有绝对影响，而在变性时间均为30 s的情况下，复性时间和延伸时间同样都是达到60 s时评分最高。综合分析得出，SRAP-PCR扩增变性30 s、复性60 s、延伸60 s，后35个循环复性温度55益时，扩增效果最好。

2.2引物的筛选及SRAP-PCR扩增程序的验证

依据正交试验得出的最佳反应程序，对已有的65对引物组合进行PCR扩增，其中，出现条带的引物组合为57对，占总引物组合的87.69%，扩增条带共计173条，表明该反应体系具有较高的扩增成功率。其中有23对引物组合扩增出的条带清晰且多态性丰富，这23对引物组合共计扩增出109条带，占总条带数的63.01%。分别挑选出上述的23对引物组合再次进行验证，SRAP-PCR扩增结果（图2）显示，筛选出的23对引物条带丰富、多态性强、稳定性好，可以用于小麦材料的遗传多样性分析、遗传图谱构建、重要性状标记等，同时用于本项目后续的试验研究。

图2　SRAP-PCR扩增程序的验证结果Fig.2 The verification results of SRAP-PCR program

3　结论与讨论

SRAP是适用于多种植物、简便高效的分子标记检测手段。SRAP与SSR分子标记由于构建原理不同，从而在诸多方面具有自己独特的特点，如SRAP-PCR程序采用复性变温法扩增。这种扩增程序分为2个阶段，前5个循环采用较低的退火温度，以保证2个引物与靶DNA部分配对，随后循环中升高复性温度，以保证前5个循环的扩增产物在余下循环中进行指数式扩增，如果复性温度在所有循环中都保持较低的退火温度，扩增片断重复性将很低[11]。不同的引物组合对不同物种扩增多态性影响很大，在利用不同SRAP组合进行多态性筛选时，尽量先统计其多态性，再分析多态性在群体中的分离[12]。如果多种引物组合产生的多态性都不丰富时，有必要对PCR扩增程序进行优化调整。陈万胜等[13]在烟草中应用的PCR程序为变性45 s，退火45 s，延伸60 s，后35个循环退火温度52益。而杨丽丽等[14]在冬枣SRAP扩增体系中将延伸时间提高到80 s。傅冰等[15]在蓝莓SRAP-PCR反应体系中应用变性时间60 s，退火时间60 s，延伸时间90 s。虽然SRAP的引物可以通用，但不同的试验对象及不同的试验环境下，应采用最适合的PCR反应体系。

本研究通过正交试验设计对小麦SRAP-PCR中的扩增程序进行了优化试验，结果显示，最佳的扩增程序是94益预变性5 min；94益变性30 s，35益复性60s，72益延伸60 s，5个循环；94益变性30 s，55益复性60 s，72益延伸60s，35个循环；72益延伸5min，4益保存。筛选出23对条带丰富、可重复性强的引物组合，适于小麦亲本材料及其后代材料的变异、遗传多样性以及亲缘关系检测与分析。这23对引物分别为Me1/Em2、Me1/Em4、Me1/Em7、Me1/Em9、Me2/ Em2、Me2/Em5、Me2/Em6、Me2/Em7、Me2/Em8、Me2/Em11、Me2/Em13、Me3/Em1、Me3/Em3、Me3/ Em5、Me3/Em7、Me3/Em9、Me3/Em10、Me3/Em11、Me4/Em4、Me4/Em5、Me4/Em10、Me4/Em13、Me5/Em1。优化后的扩增程序较最初Li等[1]的扩增程序在变性时间上有所减少，可以缩短PCR的时间；在后35个循环的复性温度上有所提高，可以增加PCR扩增反应的特异性。应用这一优化的扩增程序，成功筛选了适合于小麦的SRAP引物，并充分验证了该程序的可靠性。

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Program Optimization and Primer Screening of SRAP-PCR for Wheat

ZHANG Yan-bo1，XIAO Lei1，ZHANG Wen-juan2，ZHANG Qing-hua1，DONG Ce1，ZHANG Xi-tai1
（1.Handan Academy of Agricultural Sciences，Handan 056001，China；2.Agriculture Bureau of Handan City，Handan 056002，China）

The purpose of this study was to determine the best system of SRAP-PCR reaction and provide afoundationforfurtherstudyingthegeneticdiversityofwheat.Usingtheorthogonaldesign，the denaturation time，annealing time，extension time and annealing temperature after 35 cycles for wheat SRAP-PCR program were optimized.The results indicated that the best program was the denaturation time of 30 seconds，annealing time of 60 seconds，extension time of 60 seconds，and annealing temperature of 55益after 35 cycles.Under the optimum reaction conditions，23 out of 65 SRAP primer combinations were selected to verify the stability and reliability of this system.This optimized conditions of SRAP could used for further research of molecular marker，auxiliary breeding and genetic diversity in wheat.

Wheat；SRAP-PCR program；Optimization；Primer screening

S512.1垣1

A

1008-1631（2016）02-0055-03

2015-08-11

张彦波（1982-），男，河北武安人，助理研究员，硕士，主要从事农业生物技术及小麦育种研究。E-mail：zhangyanbo785@163.com。