蓝曼龙鱼致病性维氏气单胞菌的分离鉴定与系统进化分析

陈亨利,莫金龙,康元环,陈　龙,毕建飞,张冬星,李芳芳,李　影,单晓枫

(吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118)

蓝曼龙鱼致病性维氏气单胞菌的分离鉴定与系统进化分析

陈亨利,莫金龙,康元环,陈龙,毕建飞,张冬星,李芳芳,李影,单晓枫

(吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118)

从患病蓝曼龙鱼(Trichogaster trichopterus)体内分离到1株细菌CC0323,经人工感染试验对蓝曼龙鱼有一定致病力.采用形态学观察,生理生化鉴定,16S rRNA序列分析,构建系统发育树等方法进行鉴定.结果分离株CC0323为革兰阴性短杆菌,具多形性,在RS琼脂上可生长,呈中等大小,表面光滑的淡黄色湿润菌落;理化特性和药敏试验结果与维氏气单胞菌基本相同;系统发育树可见CC0323与维氏气单胞菌QXL0711B进化关系最近.试验结果,证明分离株CC0323为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii).

蓝曼龙鱼;维氏气单胞菌;分离鉴定;16S rRNA;系统发育分析

蓝曼龙鱼(Trichogaster trichopterus),也称蓝曼龙,属鲈形目(Perciformes),攀鲈亚目(Anabantoi⁃dei),广布于东南亚各国至太平洋热带及亚热带的淡水水域中,我国澜沧江下游也有分布[1].其体型较扁,颜色艳丽,体侧有几块形状不规则的深蓝色斑块,腹部有两条退化成长丝状的腹鳍,因这些与其他观赏鱼有着明显不同的外观特征而受到观赏鱼爱好者的喜爱.

近年来随着养殖技术的发展,蓝曼龙等热带淡水鱼走进了千家万户,对蓝曼龙的研究也逐渐开展.2015年3月,吉林长春某观赏鱼养殖场突发疾病,出现蓝曼龙大量死亡病例.病死鱼皮肤颜色变深,剖检可见消化道黏膜出血,消化道内有气体.本试验对发病的蓝曼龙鱼进行病原分离,得到一株致病菌,并对其进行生理生化鉴定,16S rRNA序列比对并构建系统发育树,研究结果报告如下.

1　材料与方法

1.1试验材料患病蓝曼龙鱼由长春某观赏鱼养殖场提供,健康蓝曼龙鱼,购自长春某花鸟鱼市场.

1.2主要试剂RS琼脂(购自北京陆桥生物技术股份有限责任公司);微量生化反应管(购自杭州天和微生物试剂有限公司);rTaq、pMD18T Vector及DNA Marker,购自TaKaRa公司;Gel Extraction kit,购自Omega公司.

1.3病原分离和细菌形态学观察无菌操作取濒死鱼肠道、肝脏、心脏、血液等组织接种于RS琼脂,于28℃培养过夜,挑取形态大小一致的优势菌落进行纯培养,保存于4℃备用.分离菌株于营养琼脂中划线,28℃培养24 h,观察菌落形态、大小和颜色;挑取典型优势单菌落进行革兰染色,镜检观察细菌形态.

1.4分离菌株人工感染试验及毒力测定将分离菌株接种于营养肉汤中,28℃振荡培养,菌落计数并用0.85%灭菌生理盐水稀释至2.82X108CFU/mL.将健康蓝曼龙鱼随机分为5个试验组和1个对照组,每组8尾.试验组分别腹腔注射0.3 mL 2X108、2X107、2X106、2X105、2X104CFU/mL的菌悬液,对照组腹腔注射0.3 mL 0.85%灭菌生理盐水.水体保持25℃并持续打氧.连续观察14 d,对观察期间死亡鱼及时剖检,观察病理变化,分离病原,记录病死鱼并应用改良寇氏法计算半数致死量.

1.5生理生化鉴定挑取分离菌株单菌落接种至微量生化反应管,28℃培养24 h结果判定以生化反应管说明书为准.

1.6药敏试验将分离菌悬液稀释至1X106CFU/ mL,取100 μL均匀涂布于营养琼脂平板,贴上卡那霉素等24种药敏纸片,30℃温箱培养20 h,观察并记录抑菌圈直径,根据美国CLSI药敏试验判定标准进行判定.

1.716SrRNA序列分析及系统发育树构建采用热裂解法制备模板,参照文献[2]操作,引物为细菌16S rRNA通用引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,其序列为:上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,下游引物5′-AC⁃GGCTACCTTGTTACGACTT-3′.PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并回收纯化,将纯化的片段连接pMD18T载体,送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序.测得的菌株16S rRNA序列经NCBI的Blast进行序列相似性比对,用MEGA6.06软件构建系统发育树进行分析.

2　结果

2.1病原分离及形态学观察病死鱼体内分离到1株致病菌,暂时命名为CC0323.该菌在RS琼脂上呈圆形、边缘整齐的黄色菌落;在营养琼脂中呈圆形,边缘整齐的半透明乳白色菌落.革兰染色镜检可见分离株为革兰阴性短杆菌,具多型性,常呈两端钝圆的短杆状,散在或成对存在.

2.2人工感染试验及半数致死量测定接种菌株CC0323后,14 d内试验组死亡情况如表1,其中大部分死亡发生在攻菌后24 h内.经计算得分离菌株CC0323对蓝曼龙鱼的半数致死量为3.6X 106CFU/mL,平均致死时间为14 h.

表1　分离菌株CC0323半数致死量的测定

2.3发病症状与病理变化病鱼初期游动缓慢或停止游动,不喜食,死亡后体色变深;肛门周围充血,腹部膨大、柔软.剖检可见腹内有腹水流出,肝脏脆易碎,肠黏膜出血,肠内胀气,所有症状与自然病例相一致.

2.4生理生化结果分离菌株CC0323能够发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、β-半乳糖等,不发酵阿拉伯糖、鼠李糖等,V-P试验呈阳性,七叶苷、卫矛醇、肌醇等呈阴性.具体的生化鉴定结果如表2,依据伯杰氏细菌鉴定手册,初步鉴定分离菌株CC0323为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii).

表2　分离菌株CC0323生化试验结果

2.5药敏试验结果药敏试验结果显示,分离株CC0323对氯霉素、磷霉素、环丙沙星、氟苯尼考、复方新诺明等药物敏感,对青霉素、多黏菌素B、氨苄西林及克林霉素表现耐药.具体药敏试验结果见表3.

2.616SrRNA gene扩增结果及系统发育分析经16S rRNA gene PCR扩增得到一段约1 500 bp大小的片段(图1),经测序片段大小为1 560 bp.

将测序得到的序列经NCBI上的Blast检索比对,发现分离菌株16S rRNA gene序列与维氏气单胞菌QXL0711B(登录号FJ808727.1)的相应序列同源性达到99%.应用MEGA6.06软件构建系统发育树(图2),可见分离菌株CC0323与维氏气单胞菌处于同一进化分支.

表3　药物敏感试验结果

图1　分离菌株CC0323 16S rRNA gene扩增结果

3　讨论

本研究从患病的蓝曼龙鱼体内分离到一株致病菌,生理生化鉴定、生物信息学分析确定分离菌株CC0323为维氏气单胞菌.经革兰染色镜下可见分离菌株为革兰阴性短杆菌,常散在或成对存在,观察到此菌具有多形性,大多为短杆状,部分呈丝状.细菌多形性的产生一方面是由于环境条件而造成的,另一方面,某些细菌,如耻垢分支杆菌,其生活史中必定存在多形性[3].在本实验室的以往实验中,发现在同一培养条件下,多株不同动物源的维氏气单胞菌菌体均存在多形性[4],或许能够表明维氏气单胞菌的生活史中同样存在多形性这一特殊过程,具体在生活史上的哪一阶段还有待进一步实验证明.

图2　基于不同气单胞菌属菌株16S rRNA序列构建的系统发育树

传统的生理生化、药敏试验鉴定和形态学观察只能大致确定菌株的革兰染色特性和分属,随着分子生物学技术的发展,16S rRNA gene序列越来越多的应用于细菌鉴定.在生物的进化过程中,16S rRNA gene序列变化十分缓慢,并且在结构和功能上具有高度保守性,可用于分析生物的进化和亲缘关系[5],因此可以用于菌株的鉴定分析.应用不同气单胞菌属菌株16S rRNA gene序列构建系统发育树,可见分离维氏气单胞菌CC0323与维氏气单胞菌QXL0711B进化关系最相近,并与其他维氏气单胞菌菌株同属一支.综合生理生化鉴定和生物信息学分析,可确定分离到的菌株为维氏气单胞菌.

维氏气单胞菌是近年来新发现的一种病原菌,广泛存在于水体环境中,该菌可引起多种经济鱼和观赏鱼发生疾病,通常表现为病死鱼出现腹水及消化道溃疡、出血[6-10],也可引起人类的腹泻甚至败血症[11-13].经过对蓝曼龙鱼的半数致死量测定,可知维氏气单胞菌CC0323在浓度低时对蓝曼龙鱼致病性较弱,但当菌浓度达到一定程度,会在较短时间内造成蓝曼龙鱼的大量死亡.因此在养殖过程中,应密切注意水体中致病微生物,定期做好消毒措施,控制养殖密度,保证水体清洁,防止致病微生物大量增殖,以消除致病菌造成的疾病隐患.

[1]陈小勇.云南鱼类名录[J].动物学研究,2013,34(4):58-58.

[2]杨小强.金鱼维氏气单胞菌的分离鉴定与药敏分析[J].现代农业科技,2013(6):256-258.

[3]马筱玲,黄谷良,林特夫.耻垢分枝杆菌发育过程中多形性观察[J].中国微生态学杂志,1993,5(1):14-17.

[4]康元环,孟庆峰,夏京津,等.乌鳢致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究[J].动物医学进展,2014(5):40-43.

[5]Harmsen D,Karch H.16S rDNA for diagnosing pathogens:aliv⁃ing tree[J].ASM News,2004,70:19-24.

[6]秦国民,张晓君,陈翠珍,等.锦鲤维氏气单胞菌感染症及其病原生物学特性研究[J].安徽农业科学,2008,36(19): 8115-8117.

[7]Rahman M,Patricia Colque-Navarro,Inger K,et al.Identifica⁃tion and characterization of pathogenic Aeromonas veronii biovar sobria associated with epizootic ulcerative syndrome in fish in Bangladesh[J].Appl Environ Microbiol,2002,68(2):650-655.

[8]房海,陈翠珍,张晓君,等.中华绒螯蟹病原维氏气单胞菌的检验[J].中国人兽共患病学报,2008,24(1):45-49.

[9]朱成科,向桢,叶华,等.黄颡鱼致病性维氏气单胞菌的分离鉴定[J].西南大学学报:自然科学版,2013,35(5):37-42.

[10]常燕,王兆慧,刘思园,等.暗纹东方鲀致病性维氏气单胞菌的分离鉴定[J].湖北农业科学,2013,52(3):629-632.

[11]王雁勇,王茜.腹水中分离出维罗纳气单胞菌温和生物变种1例[J].中华医院感染学杂志,2005,15(6):715.

[12]Joseph S W,Carnahan A M,Brayton P R,et al.Aeromonas jan⁃daei and Aeromonas veronii Dual Infection of a Human Wound Following Aquatic Exposure[J].J Clin Microbiol,1991,29(3): 565-569.

[13]Antonella Mencacci,Elio Cenci,Rosanna Mazzolla,et al.Aeromo⁃nas veronii biovar veronii septicaemia and acute suppurative chol⁃angitis in a patient with hepatitis B[J].Journal of Medical Microbi⁃ology,2003,52(8):727-730.

Isolation,identification and phylogenetic analysis of pathogenic Aeromonas veroniifromTrichogaster trichopterus

CHEN Heng-li,MO Jin-long,KANG Yuan-huan,CHEN Long,BI Jian-fei,ZHANG Dong-xing,LI Fang-fang,LI Ying,SHAN Xiao-feng
(College of animal science and technology,jilin agricultural university,changchun 130118,China)

A bacterial strain CC0323 was isolated from Trichogaster trichopterus,which had definite virulence to the fish after artificial infection.Morphology,physical and chemical characters,and 16S rRNA sequence analysis were used for identification. The results showed that strain CC0323 was gram negative.The isolate was pleomorphic,which could grow in RS agar and show a median,smooth surface,and yellow bacterial colony.The physical and chemical characters and the results of drug sensitivity test were identical with Aeromonas veronii.The phylogenetic analysis between strain CC0323 and A.veronii QXL0711B showed related homology.The results demonstrated that the isolate CC0323 was Aeromonas veronii.

Trichogaster trichopterus;Aeromonas veronii;isolation and identification;16S rRNA;phylogenetic analysis

s:SHAN Xiao-feng;LI Ying

S941.42

A

0529-6005(2016)06-0115-04

2015-05-08

国家自然科学基金项目(31201927);吉林省重点科技攻关项目(20150204065NY)

陈亨利(1991-),男,硕士生,从事动物微生物学研究,E-mail:chl9108@163.com

单晓枫,E-mail:sxf1997@163.com;李影,E-mail: thliying@163.com