LDL对小鼠精原干细胞冷冻复苏的影响试验

强者

（辽宁省昌图县动物卫生监测预警中心，辽宁　昌图112599）

LDL对小鼠精原干细胞冷冻复苏的影响试验

强者

（辽宁省昌图县动物卫生监测预警中心，辽宁昌图112599）

本试验以7d雄性昆系小白鼠为试验材料，采用非渗透性冷冻保护剂低密度脂蛋白（LDL），以1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL四种不同的浓度梯度添加到基础液中，分别在冷冻后1d、3d、和7d时检测小鼠精原干细胞的冻后复苏率。结果表明，-80℃超低温冰箱冷冻保存小鼠精原干细胞时，冷冻1d时，基础液中添加2mg/mL的LDL精原干细胞的复苏效果最高，达到86.39%，与基础液中添加1mg/mL的LDL组差异不显著，但显著优于其他组（P＜0.05）。当冷冻7d时，基础液中添加2mg/mLLDL时精原干细胞的复苏率显著高于其他组（P＜0.05）。

精原干细胞；冷冻保存；复苏率；低密度脂蛋白（LDL）

精原干细胞（SSCs）指位于曲精细管基膜上既能自我更新维持自身适量恒定，又能定向分化产生精母细胞的一类原始精原细胞。精原干细胞的冷冻保存为雄性生殖细胞以及遗传资源的保存提供了一种新的途径。低密度脂蛋白（LDL）属于非渗透性保护剂，一方面具有冷冻保护作用，另一方面还可以提供能量。本试验采用非渗透性保护剂低密度脂蛋白作为精原干细胞的抗冻剂，以检测其对精原干细胞冷冻后复苏效果，以期为精原干细胞的长期保存奠定基础。

1　试验材料与方法

1.1试验动物试验在西北农林科技大学动物科技学院遗传育种实验室进行，选择30～35只7～8日龄雄性昆明小鼠（由西安交通大学医学院试验动物中心提供）。

1.2冷冻保护剂用法本试验采用非渗透性保护剂低密度脂蛋白（LDL）作为精原干细胞的抗冻剂，以1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL的不同浓度梯度，对小鼠精原干细胞的冷冻后复苏率进行测定研究。对照组中不加任何冷冻保护剂。统计冷冻保存后第1d、3d和7d时精原干细胞冷冻后的复苏率。

1.3精原干细胞的冷冻方法本试验采用-80℃的超低温冰箱冷冻保存小鼠精原干细胞。

（1）处死7日龄的雄性昆系幼鼠，无菌迅速取出睾丸；

（2）除去脂肪膜并用PBS清洗2～3次，加入10倍体积0.25%胰蛋白酶和DNaseⅠ酶在34℃温度下消化10～15min，离心弃上清；

（3）加入等体积的胶原酶消化6～10min，DMEM/10% FBS终止消化，然后800r/min离心3min，并洗涤细胞2次；

（4）0.1%台盼蓝染色3～5min，血细胞计数板进行细胞计数；

（5）对细胞进行分离培养，待小鼠精原干细胞纯度大于75%时，将其加入到无冻存液和有冻存液的1.5mL冷冻管中，平衡后放入-80℃超低温冰箱；

（6）-80℃超低温冰箱中取出冷冻管，37℃水浴快速溶解后离心（800r/min，3min），并洗涤2次；

（7）0.1%台盼蓝染色3～5min，血细胞计数板进行细胞计数，并在倒置显微镜下随机取数个视野，统计死、活细胞数。台盼蓝拒染者为活细胞，台盼蓝染色者为死细胞，计算细胞复苏率。

2　统计分析

每个处理组和对照组均设置3个重复，结果用平均值±标准误表示。选取冷冻1、3和7d时的精原干细胞分别观察冷冻效果，所有数据采用SPSS11.5软件（SPSS，Chicago，IL，U.S.A）分析。

3　结果与分析

本试验采用非渗透性冷冻保护剂低密度脂蛋白（LDL），以1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL的不同浓度梯度，对小鼠精原干细胞的冷冻后复苏率进行测定研究。对照组中不加任何抗冻剂。统计冷冻保存第1d、3d和7d冷冻时间条件下，精原干细胞冷冻后的复苏率在所有的冷冻组中的测定结果见表1，图1。

表1　不同浓度梯度低密度脂蛋白（LDL）对精原干细胞冻后复苏率的影响（N=3，%）

由表1和图1可知，在冻存1d后，1mg/mL和2mg/mL低密度脂蛋白（LDL）细胞的复苏率均高于85%，而对照组的复苏率只有50%，差异显著。在冷冻第7d时，只有2mg/mL的低密度脂蛋白（LDL）细胞的复苏率高于70%，其余浓度的大幅度下降。

4　结论

在基础液中添加2mg/mL的低密度脂蛋白（LDL），于-80℃超低温冰箱冷冻保存时，小鼠精原干细胞的复苏效果最佳。

图1　不同浓度梯度低密度脂蛋白（LDL）对精原干细胞冻后复苏率的影响（N=3）

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.06.015