益智仁HPLC指纹图谱与其抗氧化活性

李生茂， 刘 琳， 彭 璐， 陈 珍， 顾 健， 谭 睿*（.川北医学院，四川南充67000；.西南交通大学医学院，四川成都600；.西南民族大学民族医药研究院，四川成都6004）



益智仁HPLC指纹图谱与其抗氧化活性

李生茂1， 刘 琳1， 彭 璐2， 陈 珍1， 顾 健3， 谭 睿2*
（1.川北医学院，四川南充637000；2.西南交通大学医学院，四川成都610031；3.西南民族大学民族医药研究院，四川成都610041）

目的 建立益智仁Alpinae Oxyphyllae Fructus HPLC指纹图谱，并研究其抗氧化活性。方法 HPLC法建立指纹图谱，通过相似度分析、聚类分析、主成分分析进行评价，DPPH法测定其抗氧化活性。结果 HPLC指纹图谱中有24个共有峰，相似度在0.974以上，其中12、19和21号色谱峰确定为白杨素、杨芽黄素和圆柚酮。10批样品均具有抗氧化活性，但都弱于维生素C。结论 该方法指纹色谱峰更多，分离度更高，而且分离时间更合适。

益智仁；HPLC指纹图谱；抗氧化活性；相似度分析；聚类分析；主成分分析；DPPH法

益智仁为姜科植物益智Alpinia oxyphylla Miq的干燥成熟果实［1］，主产于海南、广东、广西等地，为 “四大南药”之一，也是2002年卫生部公布的药食同源植物之一［2］，具有暖肾固精缩尿，温脾止泻摄唾的功效。现代研究发现，益智仁中含有黄酮类、萜类、二苯庚烷类等化学成分，具有神经保护、提高学习记忆、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗炎、强心和镇静催眠等作用［3-6］，其中抗氧化为其重要的活性之一，与神经保护、提高学习记忆和抗衰老等作用关系密切［3］，但目前关于其抗氧化活性成分研究的报道较少，相关成分不太明确［4、7］。长期以来，对益智的质量控制研究大多采用UV、HPLC等技术以总黄酮［8］、总多糖［9］或部分有效成分为指标的定量测定［10-14］，或以TLC［15］、IR［16］、GC-MS［17］、HPLC［18］和UPLC［19］指纹图谱定性检测为主，但这些研究以单纯的化学分析居多，而与药效结合的整体性、联系性探索较少，也未见有对益智仁HPLC指纹图谱与其活性相关性的报道。基于此，本实验对不同来源的益智仁进行了HPLC指纹图谱研究，并以其抗氧化活性为切入点，采用灰色关联度分析法研究指纹图谱色谱峰与清除DPPH自由基作用的关系，以期初步探寻其抗氧化物质基础，并为更好地控制益智仁质量提供一定依据。

1　仪器与材料

1.1仪器 Agi1ent 1220高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Sartorius BP211D AG电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ3200超声清洗器 （昆山市超声仪器有限公司），Epoch微孔板分光光度计 （美国BioTek公司）。

1.2试药 圆柚酮、1，1-二苯基苦基苯肼 （美国Sigma公司，批号分别为101340870、034K1071，含有量＞99%）；白杨素 （中国食品药品检定研究院，批号111701-200501）；杨芽黄素（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号Y-193-150703，含有量＞98%）；维生素C（成都科龙化学试剂厂，批号20130516，含有量≥99.7%）。磷酸、甲醇为分析纯；乙腈为色谱纯；水为超纯水 （自制）。

1.3药材 益智仁分别购自海南益智种植基地（编号s1～s3，s5）以及四川或广东的药厂 （s4，s6～s10），经西南交通大学生命科学与工程学院宋良科副教授鉴定为姜科植物益智Alpinia oxyphylla Miq的干燥成熟果实，具体见表1。

表1　样品信息Tab.1 Information of sam p les

2　方法与结果

2.1溶液制备

2.1.1供试品溶液 精密称取益智药材粗粉1 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入20 mL甲醇，称定质量，超声30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.2对照品溶液 精密称取白杨素、杨芽黄素和圆柚酮对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.462、2.189和16.128μg/mL的混合对照品溶液，即得。

2.2指纹图谱建立

2.2.1HPLC色谱条件 Agi1ent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相乙腈 （A）-0.4%磷酸水 （B），梯度洗脱 （0～15 min，35% A；15～32 min，35%～70%A；32～48 min，70%～77%A）；体积流量0.6 mL/min；柱温35℃；检测波长250 nm；进样量20μL。

2.2.2方法学考察

2.2.2.1精密度试验 取s1样品，按 “2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2.1”项色谱条件下连续进样6次，以圆柚酮色谱峰 （S）为参照峰，测得各主要色谱峰相对保留时间和峰面积RSD值均小于5%，表明仪器精密度良好。

2.2.2.2稳定性试验 取s1样品，按 “2.1.1”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在 “2.2.1”项色谱条件下进样，以圆柚酮色谱峰 （S）为参照峰，测得各主要色谱峰相对保留时间和峰面积RSD值均小于5%，表明溶液在24 h内稳定。

2.2.2.3重复性试验 取s1样品，按“2.1.1”项下方法制备5份供试品溶液，以圆柚酮色谱峰 （S）为参照峰，测得各主要色谱峰相对保留时间和峰面积RSD值均小于5%，表明该方法重复性良好。

2.2.3指纹图谱测定 按 “2.1.1”项下方法制备供试品溶液，分别吸取各供试品和对照品混合溶液，在 “2.2.1”项色谱条件下测定，记录48 min内色谱图，采用国家药典委员会 《中药指纹图谱相似度评价系统 （2004A）》软件，选取中位数法手动匹配，得到10批益智仁HPLC指纹图谱间的相似度及对照指纹图谱，结果见表2～3、图1～2。

表2　HPLC指纹图谱共有峰峰面积Tab.2 Peak areas of common peaks of HPLC fingerp rints

表3　HPLC指纹图谱相似度Tab.3 Sim ilarities of HPLC fingerprints

2.2.4聚类分析 将10批HPLC指纹图谱中各峰的峰面积导入SPSS13.0软件，采用Ward法，Squared Euc1idean distance聚类。结果，10批样品聚为两类，第一类包括s1～s5，第二类包括s6～s10，见图3。

图1　10批样品指纹图谱Fig.1 HPLC fingerp rints of ten batches of sam p les

图2　对照品HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of reference substances

图3　聚类分析树状图Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

2.2.5主成分分析 以10批HPLC指纹图谱中的24个共有峰的峰面积为变量［20］，采用SPSS13.0软件对其进行原始数据标准化处理及主成分分析。结果显示，第一主成分的特征值λ1为11.914，方差贡献率为49.641%；第二主成分的特征值λ2为7.586，方差贡献率为31.308%；第三主成分的特征值λ3为2.157，方差贡献率为8.986%；第四主成分的特征值λ4为1.409，方差贡献率为5.876%。前3个主成分的累积方差贡献率已达到90.235%（大于85%），故可用这3个新变量替代原有的24个变量。

将主成分载荷矩阵中的数据除以主成分相对应的特征值，并开平方根，得到两个主成分中每个指标所对应的系数。经计算，得主成分的模型为

F1=0.184 5X1+0.256 4X2+0.228 3X3+ 0.246 0X4+0.250 6X5+0.164 0X6+0.234 7X7+ 0.231 8X8+0.142 8X9+0.270 4X10+0.017 3X11+ 0.125 7X12+0.091 6X13+0.156 7X14+0.136 5X15+ 0.280 8X16+0.202 8X17+0.114 7X18+0.232 1X19+ 0.256 4X20+0.283 3X21+0.134 7X22+0.203 7X23+ 0.246 8X24。

F2=0.266 5X1-0.059 2X2-0.137 2X3-0.080 6X4+0.177 5X5+0.282 1X6+0.142 3X7+ 0.202 6X8+0.255 2X9+0.249 1X10-0.026 5X11-0.291 9X12+0.341 3X13+0.295 5X14-0.233 8X15-0.038 5X16-0.244 7X17-0.191 7X18-0.165 9X19-0.156 1X20+0.042 1X21-0.217 8X22-0.207 3X23-0.115 8X24。

F3=-0.030 0X1-0.140 9X2-0.033 4X3+ 0.273 7X4+0.008 9X5-0.027 9X6+0.202 9X7-0.117 8X8-0.234 2X9-0.066 1X10+0.641 4X11-0.191 3X12+0.014 3X13-0.070 1X14+0.278 5X15+ 0.055 8X16-0.012 9X17-0.334 3X18-0.167 5X19-0.004 8X20+0.062 6X21-0.230 8X22-0.076 9X23+ 0.225 4X24。

其中，X1、X2、…、X24为指纹图谱对应共有色谱峰x1、x2、…、x24峰面积的标准化值。

在3个主成分中，第一主成分特征值最大，贡献率最高，信息量最全面。其中，21号色谱峰（圆柚酮）的系数最大，表明其在益智仁质量控制中有相对重要的作用，结合文献 ［4］，可以将其作为益智仁质量控制的指标之一。

根据3个主成分模型，分别计算10批益智仁主成分得分，得到3维图，见图4。

图4　PCA得分图Fig.4 PCA score plot

2.3DPPH法测定抗氧化活性

2.3.1溶液配制 称取DPPH适量，加甲醇配成110μmo1/L溶液，避光保存。再精密称取维生素C适量，加甲醇制成50μg/m L溶液，避光保存。

2.3.2DPPH自由基清除作用 参考文献［21］，按 “2.1.1”项下方法提取样品，甲醇稀释成不同质量浓度 （相当于生药量）的供试品溶液。取0.15 mL，与0.15 mL DPPH溶液置于96孔板上，混匀后室温避光放置60 min，517 nm波长处测定吸收度Ai，同时测定0.15 mL甲醇与0.15 mL DPPH溶液A0，设置6个复孔，计算清除率，公式为清除率=（1-Ai/A0）×100%。以清除率 （Y）对药物质量浓度 （X）进行回归，求出清除率为50%时药物的质量浓度 （IC50），结果见表5。

另取阳性对照维生素C母液，分别稀释成1、2、3、4和5μg/mL溶液，同法测得清除率分别为8.97%、30.04%、50.07%、69.51%和88.94%。并以清除率 （Y）对药物质量浓度 （X）进行方程回归，求得阳性对照维生素 C的 IC50值为3.025μg/m L。

从结果来看，10批益智样品均具有清除DPPH自由基的活性，但均低于维生素C。

表5　10批样品抗氧化活性Tab.5 Antioxidant activities of ten batches of samples

2.4灰色关联度分析 参考文献 ［22］，以益智仁清除DPPH自由基活性IC50为母序列，HPLC指纹图谱各共有峰峰面积为子序列，分辨系数ρ取0.5，进行灰色关联度分析。结果，各色谱峰对清除DPPH自由基的贡献大小依次为x13＞x1＞x9＞x7＞x14＞x21＞x5＞x10＞x2＞x6＞x8＞x16＞x3＞x4＞x11＞x20＞x22＞x19＞x15＞x24＞x23＞x18＞x12＞x17，见表6。

表6　灰色关联度分析结果Tab.6 Results of grey relational grade analysis

3　讨论

益智化学成分复杂，富含萜类、二苯庚烷类等小极性成分，分析难度较大［3-4］。因此，本实验重点考察了影响HPLC分离效果的几个主要因素，如流动相 （甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸水、乙腈-水和乙腈-0.4%磷酸水）、体积流量 （0.6、0.8和1 m L/min）、柱温 （25、30、35和40℃）。最后确定，以柱温35℃，流动相乙腈-0.4%磷酸水，体积流量0.6 mL/min梯度洗脱，此时指纹图谱中色谱峰数量多，主要色谱峰分离度好，而且分析时间合适。

建立了10批益智仁指纹图谱，并确定了24个共有峰。相似度分析显示，10批指纹图谱整体面貌相似 （相似度在0.970以上），内在质量相对一致，仅成分含有量有差异。聚类分析结果显示，10批益智仁大致分为2类，其中采集于海南万宁（s1、s2）、海南琼中 （s4）、海南昌屯 （s5）与购于A药厂 （s4）的样品聚为一类，而购自B药厂（s6、s7和s9）、C药厂 （s8）以及D药厂 （s10）聚为另外一类。聚类结果与产地无明显相关性，推测可能与加工、储藏等因素有关，但由于样品数量较少、信息量有限，具体原因值得进一步研究。PCA分析结果显示，10批HPLC指纹图谱24个共有峰中提取了3个主成分，其投影除s8外，与聚类分析结果较为一致，两种分析方法相互印证。

目前，中药谱效关系的分析方法很多［23-24］，尚不统一，如主成分分析、相关分析、典型相关分析、多元线性回归分析、逐步回归分析、灰色关联度分析、聚类分析等等。其中，灰色关联度分析为最常用的方法之一，是根据因素之间发展趋势的相似或相异程度，亦即 “灰色关联度”，作为衡量因素间关联程度的一种方法，可描述系统发展过程中因素间相对变化的情况，如果两者在发展过程中的相对变化基本一致，则认为关联度大，反之则关联度小［23-24］。

采用灰色关联度分析法，研究了益智仁HPLC指纹图谱共有色谱峰与抗氧化活性之间的关系，发现均有不同程度的关联度，在0.636～0.499之间，表明益智仁抗氧化作用是多成分共同起效的结果。其中，12、19和21号色谱峰分别是白杨素、杨芽黄素和圆柚酮，但其他成分，特别是对益智仁抗氧化活性贡献较大的13、1、9、7和14号色谱峰各代表什么成分，究竟起到了怎样的作用，还有待于进一步研究。

本实验在建立益智仁HPLC指纹图谱的基础上，采用化学计量学方法对其进行了评价，并进一步采用灰色关联度分析法研究了其化学信息 “谱”和抗氧化活性信息 “效”之间的关系，为寻找益智仁抗氧化活性的物质基础以及其质量综合评价提供了一定的科学依据。

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HPLC fingerprints and antioxidant activity of Alpinia Oxyphylllae Fructus

LISheng-mao1， LIU Lin1， PENG Lu2， CHEN Zhen1， GU Jian3， TAN Rui2*

（1.North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，China；2.CollegeofMedicine，Southwest Jiaotong University，Chengdu610031，China；3.Institute of National Medicine，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China）

AIM To estab1ish the HPLC fingerprints of Alpinia Oxyphylllae Fructus and to study the antioxidant activity.METHODS The fingerprintswere estab1ished by HPLC and eva1uated by simi1arity ana1ysis，c1us-ter ana1ysis and principa1 component ana1ysis.The antioxidant activity was determined by DPPH method.RESULTS There were twenty-four common peaks in the HPLC fingerprints，whose simi1arties were more than 0.974.Among them，peaks 12，19 and 21 were identified as chrysin，tectochrysin and nootkatone，respective1y. Ten batches of samp1es a11 showed antioxidant activities，which were weaker than that of vitamin C.CONCLUSION Thismethod has the advantages ofmore chromatographic peaks，higher reso1ution andmore proper separation time.

Alpinia oxyphylllae Fructus；HPLC fingerprints；antioxidant activity；simi1arity ana1ysis；c1uster ana1ysis；principa1 component ana1ysis；DPPH method

R284.1

A

1001-1528（2016）06-1319-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.024

2015-10-27

国家 “重大新药创制”项目 （2013ZX09103002014，2012ZX09304005003）；2014年四川省科技创新苗子工程项目 （2014-105）；川北医学院2015年大学生开放性实验项目 （2015）

李生茂 （1981—），男，博士，讲师，从事中药药效物质基础及质量标准化研究。Te1：（0817）3300337，E-mai1：1sm9110 @163.com

谭 睿 （1969—），女，博士，教授，从事中药、民族药及复方药效物质基础及质量标准化研究。Te1：（028）87601764，E-mai1：tanrui@swjut.edu.cn