BP-ANN结合正交试验法优化白附子多糖提取工艺

吴 娜， 赵重博， 胡美变， 彭 伟， 解达帅， 吴纯洁（成都中医药大学药学院，四川成都611137）



BP-ANN结合正交试验法优化白附子多糖提取工艺

吴 娜， 赵重博， 胡美变， 彭 伟， 解达帅， 吴纯洁*
（成都中医药大学药学院，四川成都611137）

目的 采用反向传播人工神经网络 （BP-ANN）结合正交试验法优化白附子多糖提取工艺。方法 水提醇沉法提取多糖后，苯酚-硫酸法测定含有量。基于单因素试验的基础上，按照L9（34）正交表安排进行试验，考察提取温度、提取时间、料液比对多糖得率的影响，BP-ANN技术优化提取工艺。结果 最佳条件为提取时间3.5 h，提取温度90℃，料液比1∶20，多糖得率达5.20%。结论 该方法重复性良好，而且试验次数少。

白附子；多糖；提取工艺；BP-ANN；正交试验

白附子为天南星科植物独角莲Typhonium giganteum Eng1.的干燥块茎，又名禹白附，为中医临床常用毒性中药，具有祛风痰、定惊搐、解毒散结止痛等功效，主要用于各种关节疼痛、中风痰壅、口眼斜、破伤风等症状的治疗［1］。目前，对其化学成分的研究主要集中在脑苷、有机酸、甾体、挥发油、氨基酸以及毒性成分草酸钙针晶等［2-6］。近年来，多糖已成为天然药物研究开发的热点，而且天南星科植物多糖已被证实具有免疫调节、抗肿瘤等药理作用［7-9］，但有关白附子多糖提取工艺的研究尚未见报道。

反向传播人工神经网络（BP-ANN）是模拟人大脑神经网络结构和功能而建立的一种理论化的数学模型，由简单处理元件构成复杂网络，对于处理多变量、多响应的非线性复杂信息具有表达能力强大等优点，而且无需事先给出公式，通过自学习、自组织、自适应［10-11］，然后自动总结出实验数据中的规律，建立模型来拟合实际结果与期望结果。目前，神经网络已广泛用于地质勘探、化学、生物科学、食品、模式识别、图像识别、医药等领域［12-16］，用于中药提取工艺的优化也越来越多［17-19］。

本研究在单因素试验的基础上，以白附子多糖提取过程中的提取时间、提取温度、料液比为优化对象，以多糖得率为优化指标，采用正交试验法设计，根据相应数据，采用BP人工神经网络进行分析和建模，以期得到比常规方法更为精确的工艺参数，为后续研究奠定基础。

1　材料与仪器

白附子饮片购自四川新荷花中药饮片有限公司，由成都中医药大学药用植物学教研室李敏教授鉴定为天南星科植物独角莲Typhonium giganteum Eng1.的干燥块茎。经检验，符合 《中国药典》要求。

D-无水葡萄糖对照品 （中国食品药品检定研究院，批号110833-200904）。浓硫酸、苯酚、乙醇均为分析纯 （成都市科龙化工试剂厂）；实验用水为纯化水。

Autoscience AS 5150A超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；电热式恒温水浴锅 （江苏金坛宏凯仪器厂）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；LXJ-Ⅱ离心沉淀机 （上海医用分析仪器厂）；UPT-11-10T优普系列超纯水器（成都超纯科技有限公司）；DB-206SC电热鼓风恒温干燥箱 （成都天宇试验设备有限责任公司）；Scientz-10N型真空冷冻干燥机（宁波新艺生物科技股份有限公司）。

2　方法与结果

2.1白附子粗多糖的制备 取白附子饮片适量，粉碎，过20目筛，加入10倍量95%乙醇，回流提取5 h，脱脂，弃去滤液，药渣自然挥干乙醇，作为多糖提取的样品。

取已脱脂的白附子样品5 g，加入一定量纯化水，按照单因素及正交试验设计，采用热水提取，3 000 r/min离心，滤过，上清液浓缩至5～10 mL，加入乙醇使含醇量达80%，于4℃冰箱中沉淀过夜，滤过，沉淀于冷冻干燥机中干燥2 d，得白色粉末，即为白附子粗多糖［20-21］。

2.2多糖提取率的测定［8］

2.2.1对照品溶液的制备 葡萄糖对照品于105℃下恒温干燥至恒定质量，精密称取20.08 mg，配成100 mL溶液，即得0.200 8 mg/mL葡萄糖对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 精密称取已干燥的白附子粗多糖样品5 mg，置于50 mL量瓶中，超纯水定容，加热或超声使其充分溶解，滤过，即得。

2.2.3最大吸收波长的选择 精密移取对照品及供试品溶液各1.00 mL，置于不同具塞试管中，分别加入超纯水至2 mL，再加入 5%苯酚溶液1.00 mL，摇匀，再沿试管壁迅速加入7 mL浓硫酸，立即振摇，沸水浴30 min，取出，冷水浴至室温，以超纯水代替供试品溶液配制空白，在400～600 nm处扫描。结果表明，对照品及供试品溶液在490 nm处均有最大吸收，而且空白溶液在此处无干扰，因此确定检测波长为490 nm。

2.2.4线性关系考察 分别吸取葡萄糖对照品溶液0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5 mL，置于10 m L具塞试管中，按 “2.2.3”项下方法操作，于490 nm波长处测定吸光度 （A），超纯水作为空白试验。以吸光度 （A）为纵坐标 （Y），质量浓度为横坐标 （X）进行线性回归，得回归方程Y=52.67 X+0.068 9，R2=0.999，在0.003 01～0.010 04 mg/mL范围内线性关系良好（r= 0.999 5）。

2.2.5精密度试验 精密移取对照品溶液0.35 mL，按 “2.2.3”项下方法显色并测定吸光度，平行6次，测得RSD为0.23%，表明仪器精密度良好。

2.2.6稳定性试验 精密移取供试品溶液，按“2.2.3”项下方法显色，并分别在0、20、40、60、80、100 min测定吸光度，测得 RSD为0.59%，表明样品在100 min内基本稳定。

2.2.7重复性试验 精密称取白附子粗多糖5 mg，共6份，按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取1 mL，共6份，按“2.2.3”项下方法显色并测定吸光度，测得RSD为2.21%，表明该方法重复性较好。

2.2.8加样回收率试验 精密称取白附子粗多糖6份，每份5 mg，分别精密加入葡萄糖，超纯水溶解，并定容于50 mL量瓶中，加热或超声使其充分溶解，取上清液，按 “2.2.3”项下方法测定吸光度，计算回收率，结果见表1。

2.2.9多糖得率的测定 根据回归方程，计算白附子多糖液中葡萄糖的质量浓度，计算多糖得率，公式为多糖得率Y=C×D×MC/（MS×m）× 100%。其中，C为样品中葡萄糖的质量浓度（mg/mL），D为稀释倍数，MC为每份药材提取得到粗多糖粉末的质量 （g），m为称取粗多糖的质量 （mg），MS为药材的质量 （g）。

表1　加样回收率试验结果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

2.3多糖提取工艺优化 查阅文献 ［22-23］，发现影响多糖浸提的主要因素有提取次数、提取时间、提取温度以及料液比。为了探索这4个因素对多糖得率的影响，以白附子多糖得率为指标，固定其中3个因素，改变第4个因素，考察其对多糖得率的影响，寻找各个因素的取值水平。再根据各自取值水平设计并安排正交试验，将所得相应数据作为BP人工神经网络的输入和输出数据，通过数据分析与建模，最终找出提取的最佳条件。

2.3.1单因素试验

2.3.1.1提取次数对多糖得率的影响 按照“2.1”项下方法操作，提取温度为80℃，提取时间为2 h，料液比为1∶15，考察提取次数 （1～5次）对多糖得率的影响，结果见图1A。

2.3.1.2提取时间对多糖得率的影响 固定提取温度80℃，提取2次，料液比1∶15，考察提取时间 （1.5、2、2.5、3、3.5 h）对多糖得率的影响，结果见图1B。

2.3.1.3提取温度对多糖得率的影响 固定提取次数2次，提取时间2 h，料液比1∶15，考察提取温度 （60、70、80、90、100℃）对多糖得率的影响，结果见图1C。

2.3.1.4料液比对多糖得率的影响 固定提取温度80℃，提取2次，每次2 h，考察料液比 （1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）对多糖得率的影响，结果见图1D。

由图可知，提取2次后，随着提取次数的增加，多糖增加量变化不大，而且次数为非连续变量，故确定提取2次。提取时间在3 h前，多糖得率随时间的增加而增加，3 h后趋于平衡。当提取温度达到90℃时，得率最大，随着温度进一步增加，得率反而有所下降。当料液比为1∶20前，得率随加水量的增加而迅速增加，随着加水量进一步增加，得率变化不大。

图1　各因素对多糖得率的影响Fig.1 Effects of various factors on the yield of polysaccharides

2.3.2正交试验 在单因素试验的基础上，以提取温度 （A）、提取时间 （B）、料液比 （C）为变量，多糖得率为考察指标，各因素设计3水平，采用L9（34）正交表设计并安排试验，因素水平见表2，结果见表3，方差分析见表4。

表2　因素水平Tab.2 Factors and levels

表3　正交试验结果Tab.3 Results of orthogonal tests

表4　方差分析Tab.4 Analysis of variance

由表3可知，RA＞RC＞RB，即各因素对白附子多糖得率的影响程度依次为提取温度＞料液比＞提取时间。表4显示，提取温度影响最大，差异具有统计学意义 （P＜0.05），而提取时间和料液比的影响不显著 （P＞0.05）。综上所述，确定最佳提取工艺为A2B3C3，即称取白附子粗粉5 g，加入药材量25倍的水，90℃回流提取3.5 h。

2.3.3人工神经网络（ANN）分析与建模 由于具有三层结构的（1个隐含层）BP-ANN已被证实能以任意精度逼近任何有理函数［15］，故本实验以此来完成试验数据的分析与建模，所用分析软件为Mat1ab R2012a，结果见图2。

图2　BP-ANN结构Fig.2 Structure of BP-ANN

2.3.3.1网络的训练 以正交试验得到的9组数据为训练样本数据。

2.3.3.2网络结构与参数 以提取温度（A）、提取时间 （B）、料液比 （C）为输入数据，即输入层节点数为3；以白附子多糖得率为输出量，即输出节点数为1。隐含层节点数按照经典公式nh=计算，其中nh为隐含层节点数，n为输入层节点数，m为输出层节点数，a为 ［1，10］之间的常数。通过训练不同神经元数的神经网络，发现当隐含层节点数为10时，该网络能达到一定的精确度，而且训练次数少，因此确定隐含层节点数为10，其中训练函数为train1m，最大训练迭代次数为500，隐含层神经元的传递函数为tansig，输出层神经元的传递函数为pure1in，其他各项参数为默认值。

2.3.4利用BP神经网络模型筛选最佳工艺 以正交试验得到的数据为网络训练样本值，以网络预测值和实测值的误差来评价模型的性能，发现实测值和预测值平均相对误差小于1% （图3），表明训练后的网络预测性能良好，可用于白附子多糖提取结果的预测。

在正交试验的基础上，对提取时间、提取温度和料液比3个水平进行任意组合，共列出27种可能的组合情况，以其作为输入值，用已训练好的神经网络模型进行仿真模拟，通过对比输出值 （即白附子多糖得率），筛选出最佳提取工艺为提取时间3.5 h，提取温度90℃，料液比1∶20，多糖得率达5.20%。正交试验是采取部分试验来代替全面试验的方法，在减少试验次数的同时，挑选出有代表性的试验点来进行试验，通过对其结果的分析而得出结论［24］，而人工神经网络在避免大量试验的情况下，能仿真模拟所有试验条件，最终能够得出比正交试验更为精确的结果。

2.3.5验证试验 以正交试验和神经网络最终得到的优化条件为白附子多糖提取工艺参数，各平行5次。结果，在应用BP神经网络模型优化的提取工艺中，多糖得率与正交试验结果基本一致，白附子多糖得率基本保持在5.15%，与预测值基本一致，RSD为1.23%，重复性较好，显示BP人工神经网络建模结合正交试验优化工艺参数的可行性。

图3　实测值与预测值的比较Fig.3 Com parison of experimental values and predicted values

3　讨论

本实验通过单因素试验，综合考察了提取时间、提取温度、提取次数以及料液比对白附子水溶性多糖得率的影响，并筛选出各因素正交试验的取值水平。由于次数为非连续变量，考虑到产率和成本，故固定提取2次。然后，采用L9（34）正交试验设计表对提取时间、提取温度、料液比作进一步优化，再将所得数据作为BP神经网络的输入和输出数据，进行人工神经网络建模，通过训练得到3-10-1的网络模型结构，具有训练时间短，模型精度高，预测能力强，无需公式，操作简单，能够对有限个不连续点的函数进行逼近的优点。

传统的中药提取工艺的优化常采用正交试验、均匀设计、星点试验等［25-27］，但常需要大量的验证性工作，并且存在优化工艺参数不能反映多因素多水平间复杂的非线性关系。目前，人工神经网络结合多种传统工艺的优化方法能够反映多因素多水平间的变化规律，在中药工艺优化方面应用越来越广泛。

用已建立的神经网络模型对27种可能的提取条件组合进行仿真模拟，以白附子多糖得率为考察指标，筛选出最佳工艺。验证试验发现，试验值与预测值基本一致，表明该方法可行，重复性较好，而且无需增加试验次数，可为进一步研究白附子多糖奠定一定的科学依据。

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Optim izing the extraction of polysaccharides from Typhonii Rhizoma by BP-ANN combined with orthogonal test

WU Na， ZHAO Chong-bo， HU Mei-bian， PENGWei， XIE Da-shuai， WU Chun-jie*

（College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China）

AIM To optimize the extraction of po1ysaccharides from TyphoniiRhizoma by back-propagation artificia1neura1network（BP-ANN）combined with orthogona1 test.METHODS For po1ysaccharides extracted by aqueous extraction-a1coho1 precipitation techno1ogy，the content was determined by pheno1-su1furic acid method. Based on sing1e factors experiments，the L9（34）orthogona1 testwas conducted to investigate the effects of extraction temperature，extraction time，and so1id-1iquid ratio on po1ysaccharides extraction yie1d.Subsequent1y，the extraction was optimized by BP-ANN.RESULTS Provided at a 5.20%high yie1d of po1ysaccharides，the best conditionswere thus determined to be 90℃for extraction temperature，3.5 h for extraction time，and 1∶20 for so1id-1iquid ratio.CONCLUSION The work proves that thismethod has good reproducibi1ity and the advantage with fewer test times.

Typhonii Rhizoma；po1ysaccharides；extraction；BP-ANN；orthogona1test

R284.2

A

1001-1528（2016）06-1248-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.010

2015-09-29

四川省教育厅科技基础性工作专项分项目 （2014FY111100-4）

吴 娜 （1988—），女，硕士生，从事中药炮制与制剂研究。Te1：（028）61801001，E-mai1：wunagood_2008@163.com

吴纯洁 （1965—），男，博士，教授，博士生导师，从事中药炮制与制剂研究。Te1：（028）61801001，E-mai1：wcj-one@ 263.net