林可霉素发酵工艺优化降低B组分

李 华,张 立,王 鑫 ,王建国 , 谢书琴

(天方药业有限公司，河南 驻马店 463000)

林可霉素发酵工艺优化降低B组分

李 华,张 立,王 鑫 ,王建国 , 谢书琴

(天方药业有限公司，河南 驻马店 463000)

本研究通过在发酵过程中加入甲基化试剂(如甲硫氨酸、叶酸、甜菜碱或氯化胆碱等)后，能够显著地降低林可霉素B(以下简称林B)组分且同时发酵效价可提高5%左右，从而提高林可霉素A的产量，为林可霉素成本的降低和生产规模的扩大奠定了基础。

林可霉素；林B；甲基化

林可霉素是林可链霉菌(Streptomyces lincolnenisis)产生的一种林可酰胺类抗生素，主要用于冶疗革兰氏阳性菌引起的感染性疾病。林可霉素由4-丙基脯氨酸(PPL)和ɑ-甲硫基林可酰胺(MTL)通过缩合反应生成去甲基林可霉素，进一步甲基化而生成。

林可霉素及其半合成衍生物克林霉素是临床上广泛应用于抑制革兰氏阳性菌的两种林可酰胺类抗生素。我国林可霉素生产菌株发酵生产上却一直面临着有效组分林可霉素A产量不高和副产物林B含量偏高的问题。国外研究发现，发酵过程中直接添加作为前提的丙基脯氨酸可以提高林可霉素A的产量而相应减少林B的产量，但添加加甲基化试剂是否会降低林B的产量则尚未有相关报道。

1 材料与方法

1.1 菌种

林可链霉菌:Js0214-01F1 01-2#由天方药业有限公司提供。

1.2 培养基和培养方法

1.2.1 斜面培养基(%)

黄豆饼粉1.0，硫酸镁0.05，磷酸二氢钾0.005，硫酸亚铁0.005，琼脂粉等，pH值6.5～7.5；121℃保压30min。

1.2.2 种子培养基(%)

黄豆饼粉2.0，葡萄糖 2.5，硫酸铵0.2，玉米浆3.5，碳酸钙0.6等，pH值6.5～7.5；121℃保压30min。

1.2.3 发酵培养基(%)

硫酸铵1.5，磷酸二氢钾0.03，黄豆饼粉3，玉米浆2.0，碳酸钙1.0，葡萄糖8.0，pH值7.0。

2 方法与结果

2.1 分析方法

发酵效价测定：HPLC法。色谱条件：色谱柱C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相0.05mol/L硼砂溶液(用85%磷酸溶液调至pH值6.1)-甲醇(50：50)；流速0.8mL/min；柱温35℃；检测波长214nm；进样量10μL。

游离氨基氮检测:甲醛氧化测定法；

总糖、还原糖检测：斐林试剂法；

溶磷检测：钼酸铵分光光度法；

菌丝形态检查：美兰染色，光学显微镜观察。

2.2 培养条件

斜面和种子摇瓶培养温度均为30℃，培养周期分别为7～10d和2d，500mL摇瓶培养基装量为50mL，转速220r/min。发酵摇瓶按10%的接种量接入50mL的培养基中，摇床转速220r/min，30℃培养7d放瓶。

2.3 实验方案与结果

经过大量的实验最终设计几种不同的实施方案，每一种实施方案均在相同条件下进行：

实施例1 在不同周期加入0.05%的甲硫氨酸与对照相比结果如表1。

表1

由上表得出在中后期加入甲硫氨酸有利于抑制林B含量的减少，但在100h后添加又有明显的上升趋势。最后得出在发酵培养进行100h时添加甲硫氨酸，7天后放瓶效价3900μ/mL，林B组分含量1.4%。，与对照相比明显降低。

实施例2 在不同周期加入0.03%的叶酸与对照相比结果如表2。

表2

上表结果得在酵培养进行120h时添加叶酸，7天后放瓶效价4000μ/mL，林B组分含量1.3%，该结果与对照相比在效有所提高，林B组分含量也有明显下降。

实施例3 在不同周期加入0.1%的氯化胆碱与对照相比结果如表3。

表3

上表得出在发酵培养进行80h时添加氯化胆碱，7天后放瓶效价4200μ/mL，与对照相比效价有所提高且林B组分含量1.4%与对照5.0%相比大幅下降，说明在合适的时间添加氯化胆碱有利于降低林B组分含量。

实施例4 在不同周期加入0.1%甜菜碱。

表4

上表得出在发酵培养进行160h时添加甜菜碱，7天后放瓶效价为4050μ/mL，林B组分含量1.5%，林可霉素的发酵周期一般在160～180h，这说明在后期加入甜菜更利于林B的降低。

以上4个实验均为单因素实验，每个单因素添加实验都在不同程度上提高发酵效价5%左右，同时降低林B组分含量，这说明添加甲基化物质有利于发酵效价的增长，同时可降低B组分。

结合以上实验结果，设计复合添加实施方案：

实施例1 发酵培养进行100h时添加甜菜碱(添加量为培养基的0.03%)，培养120h时添加叶酸(添加量为培养基的0.02%)，7天后放瓶效价4250μ/mL，林B组分含量1.3%。相同条件下不添加甜菜碱与叶酸时的对照效价为3830μ/mL，林B组分含量4.9%。

实施例2 发酵培养进行80h时添加氯化胆碱(添加量为培养基的0.01%)，培养100h时添加叶酸(添加量为培养基的0.02%)，培养120h时添加甜菜碱(添加量为培养基的0.03%)，7天后放瓶效价4080μ/mL，林B组分含量1.5%。不添加氯化胆碱、叶酸和甜菜碱时对照效价为3827μ/mL，林B组分含量5.0%。

3 讨论

通过以上几个实验得出，不同周期在培养基中添加甲硫氨酸、叶酸、氯化胆碱和甜菜碱等甲基化物质，发现单因素添加上面几种物质可提高发酵单位5%左右，同时还可大幅降低林B组分含量的比例。

[1] 范秀容，沈 萍.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，1980：98-101.

[2] 北京大学生物系生物化学教研室.生物化学实验指导[M].北京：高等教育出版社，1979：203-205.

[3] 华东理工大学，叶蕊芳，王倩，等. 一种提高林可霉素产量的方法: CN ,101265492A[P].2008-09-17.

(本文文献格式：李 华,张 立,王 鑫.林可霉素发酵工艺优化降低B组分[J].山东化工，2016，45(08)：63-64.)

Lincomycin Fermentation Process Optimization to Reduce Part B

Li Hua , Zhang Li , Wang Xin , Wang Jianguo, Xie Shuqin

(Topfond Pharmaceutical Co., Ltd.,Zhumadian 463000,China)

In this study through add methylation reagent in the fermentation process (e.g., methionine, folic acid, betaine, or choline chloride, etc.), can significantly reduce lincomycin B (hereinafter referred to as Lin B) components and fermentation potency improves about 5% at the same time, to improve the output of lincomycin A, for lincomycin cost reduced and the expansion of production scale laid a foundation.

clindamycin; Lin B; methylation

2016-03-11

李 华(1977—)，女，河南省驻以店市人，天方药业有限公司生物技术研究所研究员，主要从事林可霉素、螺旋霉素碱、乙酰氨基葡萄糖发酵工艺优化。

R945

B

1008-021X(2016)08-0063-02