欧典螺旋霉素发酵工艺以及组分的优化研究

刘迎宾，徐 虹，万 丹，张明明，杨思聪，孙春玲

(1.西北农林科技大学，陕西 杨凌 712100；2.天方药业有限公司，河南 驻马店 463000)

欧典螺旋霉素发酵工艺以及组分的优化研究

刘迎宾1，2，徐 虹1，万 丹1，2，张明明1，2，杨思聪2，孙春玲2

(1.西北农林科技大学，陕西 杨凌 712100；2.天方药业有限公司，河南 驻马店 463000)

首先在培养基中加入不同的金属离子减少欧典螺旋霉素中的各杂质，钴离子对杂质组成成分的影响最为显著，实验证明所选金属离子都会不同程度地减少不同的杂质，因此培养基中的加入所选金属离子对于组分优化效果较好。由于加入甲基化试剂氯化胆碱能够使杂质A甲基化为主产物，因此培养基中加入0.8g/mL的氯化胆碱为较优培养条件。同时，实验证明培养时间为48h时，种子液为活力最佳状态。因此，培养基成分和培养时间都得到了优化。

欧典螺旋霉素；发酵；组分

螺旋霉素(Spiramycin，简称SPM)是一种16元大环内酯类的抗生素，具有提高体内吞噬细胞功能的作用，有较强的体内抗菌作用以及持续的抗生素后效性，而且不良反应比红霉素明显要低。临床使用已经有三十多年了，并且在治疗弓形虫等方面具有广泛的发展前景。

螺旋霉素的作用机理在于其内酯环，能够针对核糖体的50s亚基，通过阻断转移肽和m-RNA的转移进程继而阻断细菌蛋白质的合成。依据16环上第三位碳原子上的酞化程度，螺旋霉素有三种有效组分，螺旋霉素Ⅰ(SPMⅠ)未被酞化，螺旋霉素Ⅱ(SPMⅡ)，螺旋霉素Ⅲ(SPMⅢ)，后两者分别被乙酰化和丙酰化[1]。螺旋霉素的分子式如图1，它们的抗菌和抗支原体活性又随着在4"一位上酰基碳原子数目的增加而增大,即从乙酰基、丙酰基、丁酰基到异戊酰基。

图1 螺旋霉素分子式

国外生产的螺旋霉素主要组分为SPMI,各组分含量分别为Ⅰ:43%～91%,Ⅱ:2%～25%,Ⅲ:7～4既,国内生产螺旋霉素主要为组分m,组分含量分别为Ⅰ:6%～12%,Ⅱ:27%～39%,Ⅲ:52%～66%[2]。天方药业于1999年开发了国外螺旋霉素品种，因质量标准依据欧洲药典，故命名为欧典螺旋霉素。但是在杂质含量，主产物的纯化以及菌种的发酵培养条件上还需要做进一步的研究。

本人就欧典螺旋霉素的组分优化和生产工艺做了如下的研究。

1 材料与方法

1.1 菌种

1.1.1 菌种

生二素链霉菌(Strepomyces spiramyceticus)。

1.1.2 培养基

斜面孢子培养基：可溶性淀粉1%、黄豆饼粉3%、硫酸镁0.5%、碳酸钙1%、琼脂粉1%，pH值为6.4～6.7

种子培养基：可溶性淀粉1%、黄豆饼粉1%、固体玉米糊0.5%、氯化钠1%、蛋白胨0.5%，pH值为6.4～6.7。

发酵培养基：可溶性淀粉1%、黄豆饼粉1%、玉米糊2.0%、氯化钠0.5%、豆油1%，pH值6.4～6.7。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

一级培养：于斜面27℃，培养时间16～18d，种子27℃培养48h，装量30mL于250mL锥形瓶中，摇床转速为220r/min，偏心距为50mm。

二级培养： 装量25mL于250mL锥形瓶中， 27℃培养6d，摇床转速为220r/min，偏心距为50mm。测效价。

1.2.2 螺旋霉素发酵液效价的测定方法

SPM生物效价测定法：管碟法[3]。

原理:利用抗菌素在琼脂培养基内的扩散渗透作用,将已知效价的标准溶液与未知效价的样品溶液,在同样的条件下,在摊布有高度敏感性的试验菌培养基上,进行对照培养。培养一定时间后,在抗菌素到达的适当浓度范围内,产生了透明的抑菌圈,比较二者抑菌圈的大小,利用图表法推算出未知抗菌素的效价

2 结果与讨论

2.1 不同金属离子对欧典螺旋霉素组分的影响

微量金属离子对于微生物的生长有着极为重要的影响，如钴离子位于大肠杆菌蛋氨酸氨基肤酶、缓症链球菌的氨基肤酶以及乳杆菌属的二肤酶的活性中心位置，为微生物生长所必须的微量元素。低浓度的金属离子是微生物的营养物质，而浓度过高时则会抑制微生物的生长，甚至造成毒害。

而研究表明，已知欧典螺旋霉素中有四种不同且难以分离的杂质，而不同的金属离子对欧典螺旋霉素杂质有不同的影响。本人在培养基中加入不同金属离子[4]，筛选出对主要杂质影响最为显著的金属离子，减少杂质，优化欧典螺旋霉素的发酵组分。

将各种金属离子分别加入到培养基中，以测定SPM效价的方法进行最终效果的鉴别，见表1。

表1 培养基中加入不同金属离子的实验序号

根据SPM评价效价结果如下表2 。

表2 加入各金属离子的发酵组分及其产量

从表可以看出，各个金属离子对于欧典螺旋霉素主产物、杂质效价均有影响，SPM的含量和杂质的总量呈一种平衡关系。硫酸铵和硝酸铵和氯化钾对杂质C的影响较大，氯化钾、硫酸锌以及氯化钴对杂质A和D的影响较大，以氯化钴的影响最为显著，且氯化钴对杂质C的影响也很大，其次为硝酸铵。

2.2 生产发酵工艺的优化

欧典螺旋霉素的产量以及纯度都与种子液有着密不可分的关系，而种子液的质量又取决于培养基组成成分、培养温度、培养时间以及接种量等因素。

表3 培养基不同成分的实验序号

结合以上根据金属离子对欧典螺旋霉素杂质的组成成分以及比例都有显著的影响，因此把硫酸铵、硝酸铵、氯化钾、硫酸镁、硫酸锌、氯化钴都加入培养基中，加入其它可能影响种子液生长情况以及SPM含量的试剂，改变培养时间，观察菌种浓度以及生长情况，选择生长情况良好检测效价。

另外，在检测杂质的过程中，我们发现杂质A的结构只比主产物SPM1缺少一个甲基，因此，尝试加入甲基化试剂，检测是否能加强甲基化作用，减少杂质含量，增加主产物SPM1比例。

2.2.1 培养基成分优化

原有的培养基成分营养不够丰富，氮源、碳源成分易耗尽，影响菌体的繁殖，而且也不利于产物的积累。因此增加碳源和氮源的比例，调整种子培养基的碳氮比。优化方案斜面孢子培养基不变，种子培养基以及发酵培养基中在加入金属离子的基础上添加更多的碳源和氮源。

进行48h，37℃的培养。结果如下表4。

表4 不同培养基菌体生长情况以及效价评定

从结果来看，原种子培养基玉米糊改成1%+金属离子的培养基对于种子液的生长情况以及主产物SPM1的产量和螺旋霉素的效价，相比而言都是更为合适的，以下培养时均用此培养基。

2.2.2 甲基化试剂的影响

选取三种甲基化试剂：叶酸、氯化胆碱以及甜菜碱。根据参考文献，向培养基中加入终浓度为0.8g/mL的甲基化试剂[5]。

表5 加入不同甲基化试剂后杂质情况和效价评定

实验结果表5初步证明，叶酸和甜菜碱对于减少杂质成分，提高主产物的含量没有太大的效果，氯化胆碱对螺旋霉素的生物合成有明显的促进作用。

2.2.3 培养时间

种子液的培养时间与发酵的效果有着密切的关系，选取种子液在菌的对数生长期时，生长繁殖都较活跃，能迅速适应发酵罐中的生长环境，获得最大程度的产量。若是菌种生长已经处于断枝状态，即为已经开始老化，不宜进入发酵罐扩大培养。本人选取了24h，48h，60h，72h的培养种子液，进行分析比对。结果如下表6。

表6 不同培养时间及其菌丝生长情况

结果可以看出，培养时间为48h时最为合适，能获得生长旺盛，质量较好的菌体。

3 讨论

通过以上实验，通过改变培养基的成分实现了欧典螺旋霉素的组分优化，得到了杂质相对较少主产物SPMⅠ能够达到80%的螺旋霉素。但是这只是一个初步的条件选择，比如金属离子对杂质的改变仍然需要进一步的探讨研究，还可以从菌种选育入手，优化菌种，获得较优的突变菌种。期望较优菌种结合较优生产条件能在工业上扩大培养，获得较好的医学效益和经济效益。

[1] 朱 峰,王尔健.螺旋霉素的再评价[J].中国抗生素杂志,1991,16(3):231-236.

[2] Anne BrissonNo⊇l , Patrick TrieuCuot , Patrice Courvalin .Mechanism of action of spiramycin and other macrolides[J].J Antimicrob Chemother ,1998,22(Suppl B)：13-23.

[3] Webster Carol, Ghazanfar Katayoun, Slack Richard. Subinhibitory and post-antibiotic effects of spiramycin and erythromycin on Staphylococcus aureus[J].J Antimicrob Chemother ,1988,22(Supple B): 33-39.

[4] 李友元，陈长华, 顾熠峰,等，基于液质联用技术解析和降低螺旋霉素发酵杂质[J].生物工程学报，2005,21(2):275-278.

[5] 叶蕊芳, 史婷婷 ,张 燕,等，维生素螺旋霉素发酵的影响[J].化学与生物工程，2008,25(10):64-67.

(本文文献格式：刘迎宾，徐 虹，万 丹.欧典螺旋霉素发酵工艺以及组分的优化研究[J].山东化工，2016，45(02)：25-27.)

2015-12-07

刘迎宾(1981—)，河南驻马店人，学士学位，工程师，主要从事抗生素发酵的研究；通讯作者：徐 虹，西北农林科技大学。

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