贵州及周边地区斑蝥资源抗人肝癌HepG2细胞的活性研究*

郭　侃，李晓飞，晏　容，刘　云，张　沛，刘　流△（.遵义医学院基础医学院，贵州遵义5600；.贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，遵义5600；.贵州省柏强制药有限公司，贵阳550000）

贵州及周边地区斑蝥资源抗人肝癌HepG2细胞的活性研究*

郭侃1，李晓飞1，晏容1，刘云2，张沛3，刘流1△
（1.遵义医学院基础医学院，贵州遵义563003；2.贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，遵义563003；3.贵州省柏强制药有限公司，贵阳550000）

目的初步分析贵州及周边不同地域种斑蝥体内结合斑蝥素的含量，筛选出抗人肝癌HepG2细胞效果显著的地域种。方法采用水提结合斑蝥素方式提取有效成分，运用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析提取液内的结合斑蝥素含量，采用磺酰罗丹明染色法（SRB法）考察提取液对人肝癌HepG2细胞的体外抗肿瘤活性，应用倒置相差显微镜检测凋亡细胞的形态学变化。结果贵州省罗甸县境内南方大斑蝥与黄黑小斑蝥体内所含结合斑蝥素含量均高于其他地区同种斑蝥，分别为375、290 mg/L；不同地域种的斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞的增殖均有抑制作用，其中贵州茂丼镇境内的2种斑蝥对人肝癌HepG2细胞的抑制效果明显优于其他地区同种斑蝥，其半数抑制浓度（IC50）分别为0.78、0.65 mg/L；形态学观察结果显示，茂丼镇南方大斑蝥体内结合斑蝥素可促进人肝癌HepG2细胞凋亡，且凋亡细胞呈现典型的形态特征。结论不同地域不同种斑蝥体内结合斑蝥素的含量存在较大差异；茂丼镇境内2种斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞的抑制效果优于其他地域种，可进行深入研究。

斑蝥；斑蝥素；肝肿瘤；肿瘤细胞，培养的；气相色谱-质谱法；贵州

一直以来，斑蝥素被认为是斑蝥体内的抗癌活性物质［1］，但本课题组的前期研究发现斑蝥素在斑蝥体内有2种存在形式——游离斑蝥素和结合斑蝥素［2］。进一步研究发现，这些结合斑蝥素多数为斑蝥素盐类衍生物，并且这些斑蝥素盐类衍生物的种类及含量在不同地域的不同种斑蝥之间存在着很大的差异［3］，因此抗肿瘤效果也有巨大差异［4-9］。斑蝥在我国分布较广，主产于贵州、广西、陕西、云南、四川等省，但目前对其药用资源的系统研究较少。本研究通过对贵州及周边地区的斑蝥资源进行系统深入的采集、鉴定和归类，测定斑蝥中结合斑蝥素的含量；以斑蝥素酸钠为阳性对照，测定不同地域不同种斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞的抑制活性，筛选出抗肿瘤活性较好的优良地域种。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1斑蝥虫来源斑蝥虫体收集自贵州若干县、区、乡、镇及四川、云南、广西和陕西等产区，经遵义医学院李晓飞博士鉴定各个产区的虫体分别为南方大斑蝥与黄黑小斑蝥（以地区后缀“大”和“小”分别表示南方大斑蝥与黄黑小斑蝥）。

1.1.2试剂人肝癌HepG2细胞和斑蝥酸钠均由遵义医学院医学与生物学研究中心提供。斑蝥素标准品购自上海Aladdin公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；磺酰罗丹明（SRB）购自美国Sigma公司；胰蛋白酶、其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3仪器Agilent 6890-5973N气相色谱质谱联用仪购自美国安捷伦公司；Agilent HP-5MS色谱柱购自美国安捷伦公司。3131型CO2培养箱、Multiskan spectrum全波长酶标仪购自美国Thermo公司；超净工作台购自苏州净化设备有限公司；Ti-S倒置相差显微镜购自日本Nikon公司；超纯水制备系统购自美国Millpore公司。

1.2方法

1.2.1结合斑蝥素提取纯化［10］将斑蝥成虫虫体烘干后用粉碎机粉碎，干燥后置于容器中，加入足量三氯甲烷，摇匀，静置24 h，过滤，残渣用三氯甲烷冲洗3次，干燥，获得去除游离斑蝥素的斑蝥粉末，取质量为20倍的蒸馏水浸泡24 h，过滤，即得结合斑蝥素水提液，抽滤除菌，备用。

1.2.2斑蝥素的萃取取10 mL结合斑蝥素水提液，加入20 mL三氯甲烷，再加入2 mL浓盐酸；加入正十六烷内标液10 μL固定；摇匀，静置萃取4 h；分离收集下层氯仿液，待测。

1.2.3气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析条件色谱柱为AgilentHP-5MS色谱柱（30.00mm×0.25mm，0.25μm），载气：高纯氦气（He），流速0.5 mL/min，不分流；质谱电离方式：电子轰击电离（EI），电子能量70 eV；进样口温度250℃，程序升温：初始温度50℃，以20℃/min升至260℃，保持5.0 min；溶剂延迟4.2 min；四极杆温度150℃；离子源温度230℃；质量扫描范围m/z 30～500；用峰面积归一化法计算各组分的相对质量分数，对色谱峰总峰面积初始阀值大于15.0、初始峰宽大于0.102的成分进行积分和鉴定，利用美国WILEY7-NIST05和NIST05谱库检索比对，并对图谱进行解析，从而得到化合物的结构。

1.2.4细胞培养人肝癌HepG2细胞采用RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清），37℃、5%饱和湿度的CO2培养箱培养。待细胞长至对数生长期，弃去培养液，PBS冲洗，0.25%胰蛋白酶消化，加培养液吹打均匀成单细胞悬液，取100 μL细胞悬液（含8 000～10 000个细胞）接种于96孔培养板，于CO2培养箱中培养。

1.2.5SRB染色法［11］接种肝癌HepG2细胞时，平行接种3块96孔板，一块为对照板（T0），另2块为实验板。CO2培养箱中培养20 h后，将对照板（T0）取出，用预冷的50%三氯乙酸（TCA）固定，待测。实验板中分别加入不同地域不同浓度的结合斑蝥素并设实验组（T）、阴性对照组（C）、阳性对照组（斑蝥酸钠2.71 mg/L）、溶剂对照组；阴性对照孔加入培养液100 μL，每组设5个复孔，继续培养48 h后取出培养板，以预冷的50%TCA固定（终浓度为10%），1 h（4℃）后以去离子水冲洗，自然晾干，用100 μL 0.4%SRB染色，10 min后用0.1%醋酸冲洗、晾干，最后用200 μL 10 mmol/L的缓冲Tris碱液（pH 10.5）溶解，在酶标仪上选择530 nm处测吸光度值（OD值），按照下列公式计算生长抑制率（IR）。

1.2.6茂丼境内南方大斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞形态的影响将HepG2细胞接种于6孔板，培养24 h后，用不同浓度的结合斑蝥素分别作用于癌细胞，并设空白对照组，48 h后将其置于倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化。

1.3统计学处理应用SPSS16.0统计软件进行数据处理，所有计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1不同产地、不同品种斑蝥体内结合斑蝥素含量的分析结果由GC-MS实验结果可知，贵州省罗甸县境内南方大斑蝥与黄黑小斑蝥体内所含结合斑蝥素较其他地区内的同种斑蝥体内含量高，分别为375、290 mg/L；在周边4省中云南境内南方大斑蝥、广西境内黄黑小斑蝥体内结合斑蝥素较其他省份同种斑蝥含量多，分别为84、134 mg/L。见表1。

2.2斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞增殖的影响将所提取的不同结合斑蝥素稀释成不同浓度分别作用于肝癌HepG2细胞，以结合斑蝥素浓度为横坐标，IR为纵坐标作回归曲线，计算其半数抑制浓度（IC50），见表2。由表3所示，不同浓度的茂丼镇南方大斑蝥与黄黑小斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞的生长抑制作用分别在0.52～1.57 mg/L和0.40～1.99 mg/L，且呈剂量依赖性，随着浓度的增加，抑制效果逐渐显著。以药物浓度为横坐标，IR为纵坐标作回归曲线，茂丼镇南方大斑蝥对应的回归方程为Y=47.423Ln（X）+62.109，R2= 0.988 7；茂丼镇黄黑小斑蝥对应的回归方程为Y=38.241 Ln（X）+66.714，R2=0.986 3，其镜内的南方大斑蝥与黄黑小斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞的抑制作用明显优于其他地区同种斑蝥。

表1　不同产地、不同品种斑蝥体内结合斑蝥素含量的分析结果

表2　不同产地、不同品种斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞增殖的影响（mg/L）

表3　茂丼（大）、茂丼（小）斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

2.3茂丼镇南方大斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞形态的影响图1为茂丼南方大斑蝥结合斑蝥素作用于HepG2细胞48 h后所观察结果，与空白对照组比较，当结合斑蝥素质量浓度为0.52 mg/L时，细胞数目略减少，且形态少许变圆、变亮；随着药物浓度增加到0.79、1.05 mg/L时，细胞数目明显减少，形态不规则，并出现固缩、体积变小现象，细胞贴壁差；当药物浓度达到1.30、1.57 mg/L时，细胞存留很少，大部分细胞已坏死或凋亡，形态变化更加明显。

图1　茂丼镇南方大斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞形态的影响（100×）

3　讨　论

芫菁科昆虫在我国目前已知有15属130多种，因贵州具有较独特的地理与气候特性，决定了其昆虫分布的广泛性与多样性，贵州可能分布着多于20种产斑蝥素的昆虫［12］。但当前开发与应用的力度还远远不够。有研究证实，芫菁体内斑蝥素盐类衍生物即结合斑蝥素含量显著多于斑蝥素，进一步分析发现，这些斑蝥素盐类衍生物多是以镁、钙、钾、锌、钠等盐类为主［2-3］。本研究采用水提结合斑蝥素的方法，通过GC-MS分析斑蝥体内结合斑蝥素含量，结果显示，不同地域不同种斑蝥体内的结合斑蝥素含量也不同，存在地域和种类的差异。贵州省罗甸县境内2种斑蝥体内的结合斑蝥素含量普遍高于其他地区同种斑蝥体内含量，四川、云南、广西及陕西4省境内的黄黑小斑蝥体内所含结合斑蝥素多于同地区的南方大斑蝥体内含量。

在此基础上，以斑蝥素酸钠为阳性对照，测定不同地域不同种斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞的抑制活性。结果显示，不同地域种斑蝥体内的结合斑蝥素对肝癌HepG2细胞均有一定的抑制作用，其抑制活性呈现出地域和品种的差异性。其中贵州茂丼镇境内的南方大斑蝥与黄黑小斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞的抑制作用明显优于其他地区同种斑蝥。

本研究通过对贵州及周边地区斑蝥体内结合斑蝥素进行提取、含量测定，并对其进行体外抗肿瘤活性测定，初步筛选出抗肿瘤活性显著的地域种。下一步本课题组将对优良地域种进行培育繁殖，提取分离其活性部位或活性物质，并对分离提取物进行抗肿瘤效果评价。为更好地开发利用斑蝥这一宝贵的昆虫资源提供必要的科学依据。

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Anti-human hepatocellular carcinoma HepG2cells activity of cantharidin derived from Guizhou Province and surround-ing regions*

Guo Kan1，Li Xiaofei1，Yan Rong1，Liu Yun2，Zhang Pei3，Liu Liu1△（1.Basic Medicine School，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；2.Guizhou Provincial College-based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines，Zunyi，Guizhou 563003，China；3.Guizhou Baiqiang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guiyang，Guizhou 550000，China）

ObjectiveTo preliminarily analyze the in vivo bound cantharidin content derived from the different geographic variants of Mylabrise in Guizhou Province and surrounding regions for screening out the geographic variant with the obvious effect for anti-human hepatocellular carcinoma HepG2cells.MethodsThe water extracting bound cantharidin mode was adopted to extract the effective ingredients；the bound cantharidin content in the extracting solution were analyzed by using GC-MS；the sulforhodamine B（SRB）assay was employed to evaluate the in vitro anti-tumor effect of the extracted liquid on hepatocellular carcinoma HepG2cells；the morphological alteration of apoptotic cells was detected by phase contrast microscopy.ResultsThe bound cantharidin content of Mylabrisphalerata Pallas and Mylabriscichorii Linnaeus collected in Luodian County of Guizhou Province were higher than that of the same species of Blister beetle collected from other regions，which were 375 mg/L and 290 mg/L，respectively；bound cantharidin from different geographical species all had the inhibitory effects on the proliferation of hepatocellular carcinoma HepG2cells，in which two kinds of cantharis in the Maojing town of Guizhou Province had the more significantly inhibitory effects on the proliferation of hepatocellular carcinoma HepG2cells than that of the same cantharis in other areas，and its median inhibitory conventration（IC50）value was 0.78 mg/L and 0.65 mg/L respectively；the morphological observation results showed that in vivo bound cantharidin of Blister beetle in the Maojing town could promote the apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2cells，moreover the apoptotic cells appeared typical morphological characteristics.ConclusionThe bound cantharidin content has large difference among the different kinds of cantharis collected from different regions.The inhibitory effects of bound cantharidin from two kinds of cantharis in the Maojing town on the proliferation of hepatocellular carcinoma HepG2cells is superior to other geographic species，which may be deeply researched.

Mylabris；Cantharidin；Liver neoplasms；Tumor cells，cultured；Gas chromatography-mass spectrometry；Guizhou

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.05.004

A

1009-5519（2016）05-0648-03

国家自然科学基金项目（81260488）；贵州省科技厅中药现代化项目（黔科合SY字［2013］3012）；贵州省科技厅社会发展攻关项目（黔科合SY字［2012］3082）；贵州省教育厅特色重点实验室建设项目（黔教合KY字［2014］212）。

郭侃（1986-），在读硕士研究生，主要从事昆虫资源开发与利用方面的研究。

△，E-mail：403365478@qq.com。

（2015-12-03）