响应面法优化淡竹叶总黄酮的大孔树脂纯化工艺

朱俊访　李　博



中药研究

响应面法优化淡竹叶总黄酮的大孔树脂纯化工艺

朱俊访李博

(广东食品药品职业学院,广州,510520)

目的:探讨响应面法优化淡竹叶总黄酮大孔树脂纯化工艺。方法:比较四种大孔树脂对淡竹叶总黄酮的吸附和解吸性质,筛选合适的树脂,采用响应面法优化纯化工艺。结果:通过实验数据分析,较佳纯化工艺条件为上样液质量浓度0.12 g/mL,乙醇体积分数75%,洗脱液用量6BV。结论:通过响应面法优选的淡竹叶总黄酮大孔树脂纯化工艺稳定可行,预测性好。

淡竹叶;总黄酮;大孔树脂;响应面法

中药淡竹叶为禾本科植物淡竹叶(Lophatherum gracile Brongn.)的干燥茎叶,性寒,味甘、淡,归心、胃、小肠经,有清热除烦,利尿的功效,用于热病烦渴,小便赤涩淋痛,口舌生疮等症[1-4]。淡竹叶主要含有黄酮、三萜类、多糖、酚性成分、氨基酸、有机酸及多种微量元素,其中黄酮为主要有效成分[5-8]。本实验以淡竹叶总黄酮为对象采用大孔树脂进行纯化,通过响应面法对工艺进行优化,为淡竹叶总黄酮的进一步开发和利用提供科学依据。

1　资料

1.1仪器 电子天平:AUY120,岛津;分光光度计: UV2600,尤尼科仪器有限公司

1.2受试药物 淡竹叶(市售),干燥后粉碎过60目筛备用;大孔树脂:D101、AB-8、S-8(天津光复精细化工)DA-201;郑州勤实科技有限公司;试剂均为国产分析纯。

2　方法

2.1标准曲线绘制 以芦丁为对照品,在510 nm下采用硝酸铝-亚硝酸钠法测定黄酮含量。准确称取标准品逐级稀释,精密吸取上述稀释液2 mL,置50 mL量瓶,并以80%乙醇补充至12.0 mL,加入5%NaNO2溶液1.5 mL,混匀,放置6min后加入10%Al(NO3)3溶液1.5 mL,混匀,6min后再加入4%NaOH溶液20 mL,混匀,用水定容。得到浓度为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/ mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL的芦丁溶液,以阴性对照为空白,于510 nm波长处测吸光度,得到回归方程y=11.023x+0.0295,R2=0.999 2[9]。

2.2上柱液制备 取淡竹叶50 g,粉碎过50目筛,石油醚脱脂,80℃水浴下以500 mL 80%乙醇回流提取2h,将提取液浓缩离心,加水定容至250 mL,调节pH值为6.0,得竹叶黄酮供试液(相当于0.2 g生药/mL)。

2.3大孔树脂预处理 大孔树脂用95%乙醇浸泡24h,再用95%乙醇冲洗,至流出液加蒸馏水无白色混浊、无异味,继续用蒸馏水洗至无醇味,备用。

3　结果

3.1树脂静态吸附考察 准确称取已处理的4种(AB-8、S-8、D101、D201)大孔树脂20 g,分别置于250 mL具塞三角瓶中,分别精密吸取10 mL供试液,加水稀释至100 mL,振荡吸附24h,滤过,滤液吸取2 mL按2.1项下方法测定。滤渣水洗,抽滤,用滤纸吸干,准确加入80%乙醇100 mL,振荡解吸24h,滤过,滤液吸取2 mL按3.1项下方法测定,其余滤液置水浴挥干,恒重[10-11]。结果见表1,可以看出D101型树脂对淡竹叶黄酮具有较佳的吸附和洗脱效果。

表1　4种树脂对总黄酮的影响

3.2动态吸附单因素试验

3.2.1上样液质量浓度的影响 取处理好的D101大孔树脂20 g,取0.2 g/mL、0.4 g/mL、0.6 g/mL的样品溶液,按2 BV/h的体积流量通过树脂柱,测定不同上样体积条件下流出液黄酮含量,直到吸附饱和出现泄漏点,绘制泄露曲线。见图1。质量浓度为0.2 g/mL和0.4 g/mL的上样液均在2 BV(40 mL)达到泄漏点,0.6 g/mL的上样液在1.5BV(30 mL)达到泄漏点,且质量浓度为0.2 g/mL的上样液吸附率最高,因此初步决定上样体积为2 BV。

图1　上样液质量浓度对树脂吸附效果的影响

3.2.2洗脱液乙醇体积分数的影响 取处理好的D101大孔树脂20 g,吸附2 BV 0.2 g/mL的样品溶液,用2BV蒸馏水洗脱,再分别用35%、50%、65%、80%、95%的乙醇,以2 BV/h的流速洗脱,绘制吸附曲线。见图2。当洗脱液乙醇的体积分数大于65%,洗脱率增加比较缓慢,因此初步决定较优乙醇体积分数为80%。

3.2.3洗脱液乙醇用量的影响 取处理好的D101大孔树脂20 g,吸附2BV 0.2 g/mL的样品溶液,用2BV蒸馏水洗脱,再分别用1、2、4、6、8、10 BV体积分数为80%的乙醇,以2 BV/h的流速洗脱,绘制吸附曲线。见图3。当洗脱液用量超过2BV(40 mL)体积后,再增加用量洗脱率增加缓慢,因此初步确定较优洗脱液用量为4BV(80 mL)。

图2　乙醇体积分数对树脂吸附效果的影响

图3　乙醇用量对树脂吸附效果的影响

3.3效应面优化D101大孔树脂纯化工艺

3.3.1试验设计 取处理好的D101大孔树脂20 g,考察上样液质量浓度(A)、洗脱液乙醇体积分数(B)及洗脱液用量(C)对黄酮洗脱率和纯度的影响,采用DesignExpert 8.0统计分析软件的响应面分析法安排试验,以获取最适工艺参数。采用3因素3水平的响应面分析法进行试验设计,因素水平见表2,试验安排及结果见表3。对评价指标洗脱率和黄酮含量标准化为0～1之间的值,再求几何平均值得“总评归一值(OD)”,以OD值为评价指标对纯化工艺进行优化[12-16]。

表2　因数水平设计表

表3　响应面分析试验设计及结果

3.3.2模型拟合及方差分析 以OD值对各因素进行多元线性回归和二项式拟合,各项系数进行方差分析,得多元线性回归方程Y=0.5175-0.2585A+ 5.625×10-3B+0.1531C(R2=0.517 4,P=0.020 3),虽然P值通过检验,但相关系数过小,模型拟合度不高,预测性较差。二项式拟合模型为Y=0.7450-0.2585A+5.6257×10-3B+0.1532C-0.0786AB+ 0.0743AC-0.1504BC-0.1634A2-0.2142B2-0.1058C2(R2=0.894 9,P=0.010 4),方程显著并相关系数较高,可作为分析及预测的模型。

图4　上样液质量浓度与乙醇体积分数对OD值的交互影响

3.3.3最佳工艺条件预测与验证 根据回归方程,做响应面图(图4～6),分析上样液质量浓度、乙醇体积分数和洗脱液用量对总黄酮提前的影响。根据拟合方程结果显示,淡竹叶总黄酮大孔树脂纯化的最佳工艺条件为:上样液质量浓度0.12 g/mL,乙醇体积分数75%,洗脱液用量5.96 BV。按最佳工艺条件进行3次验证试验,实测计算的OD值平均值为0.893 2,与预测值的相对误差为3.31%。OD值的预测值与实测值相对误差较小,表明建立模型可靠,具有良好的预测性。

4　讨论

本实验采用响应面法优化淡竹叶总黄酮的大孔树脂纯化工艺,通过静态吸附试验筛选出D101型树脂,最终确定较优的纯化条件为上样液质量浓度0.12 g/mL,乙醇体积分数75%,洗脱液用量6BV。分析实验结果得出上样液浓度、洗脱液的浓度和用量对黄酮纯化有不同程度的影响,其中洗脱液的用量影响最显著,各因素间存在不同程度的交互作用。效应面的优化结果与试验值差异小,对大孔树脂纯化淡竹叶总黄酮的纯度,具有一定的推广应用价值。

图5　上样液质量浓度和洗脱液用量对OD的交互作用

图6　乙醇体积分数和洗脱液用量对OD值的交互影响参考文献

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(2015-10-15收稿 责任编辑:张文婷)

Optimization of Purification Technology Using Macroporous Resin for Total Flavonoids from Lophatherum Gracile with Response Surface Method

Zhu Junfang,Li Bo
(Guangdong Food anddrug Vocation College,Guangzhou 510520,China)

Objective:To optimize purification technology using macroporous resin for total flavonoids from lophatherum gracile with response surface method.Methods:Compare the adsorption anddesorption properties of four macroporous resin on total flavonoids of lophatherum gracile.Select the appropriate resin to optimize purification process with response surface method.Results:According to the analysis of experimentaldata,it was better to optimize purification process with the mass concentration 0. 12 g/mL of sample solution,volume fraction 75%of ethanol and eluentdosage 6BV.Conclusion:It was stable and feasible with good predictability to optimize the macroporous resin purification process for total flavonoids from lophatherum gracile with response surface method.

Lophatherum gracile;Total flavonoids;Macroporous resin;Response surface method

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.04.039

朱俊访(1981.06—),男,硕士,实验师,研究方向:天然产物有效成分分离与分析,E-mail:junfang-zhu@163.com

李博(1982.07—),女,硕士,实验师,研究方向:中药有效成分和质量标准,E-mail:lib@gdyzy.edu.cn